Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo
Summary
El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.
Abstract
El protocolo actual describe métodos para generar tejidos cardíacos (ECT) de ingeniería en forma de malla escalables compuestos por células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), que se desarrollan hacia el objetivo del uso clínico. Los cardiomiocitos derivados de HiPSC, las células endoteliales y las células murales vasculares se mezclan con matriz de gel y luego se vierten en un molde de tejido de polidimetilsiloxano (PDMS) con postes escalonados internos rectangulares. Por día de cultivo 14 ECT maduran en una estructura de malla de 1,5 cm x 1,5 cm con paquetes de miofibra de 0,5 mm de diámetro. Los cardiomiocitos se alinean con el eje largo de cada haz y golpean espontáneamente sincrónicamente. Este enfoque se puede escalar hasta un ECT de malla más grande (3,0 cm x 3,0 cm) conservando la maduración y función de construcción. Por lo tanto, los ECT en forma de malla generados a partir de células cardíacas derivadas de hiPSC pueden ser factibles para los paradigmas de regeneración cardíaca.
Introduction
Numerosos estudios preclínicos y ensayos clínicos han confirmado la eficiencia de las terapias regenerativas cardíacas basadas en células para corazones en quiebra1,2,3. Entre varios tipos de células, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son fuentes celulares prometedoras en virtud de su capacidad proliferativa, potencial para generar varios linajes cardiovasculares4,,5,y alogenicidad. Además, las tecnologías de ingeniería de tejidos han hecho posible transferir millones de células a un corazón dañado5,,6,7,8.
Anteriormente, informamos de la generación de tejidos cardíacos de ingeniería lineal tridimensional (3D) (ECT) a partir de linajes cardiovasculares derivados de hiPSC utilizando un sistema de cultivo disponible comercialmente para tejidos bioartificiales 3D5,,7. Encontramos que la coexistencia de células endoteliales vasculares y células murales con cardiomiocitos dentro de la ECT facilitaba la maduración del tejido estructural y electrofisiológico. Además, validamos el potencial terapéutico de los hiPSC-ECT implantados en un modelo de infarto de miocardio de rata tolerante al inmunelí para mejorar la función cardíaca, regenerar el miocardio y mejorar la angiogénesis5. Sin embargo, los ECT lineales construidos por este método eran cilindros de 1 mm por 10 mm y, por lo tanto, no eran adecuados para la implantación en estudios preclínicos con animales más grandes o uso clínico.
Basándonos en el uso exitoso de moldes tisulares para generar la formación de tejidos de ingeniería porosa utilizando mioblastos esqueléticos de rata y cardiomiocitos9,cardiomiocitos humanos derivados de ESC10 y iPSCsde ratón 11,desarrollamos un protocolo para generar tejido implantable más grande derivado de hiPSC escalable utilizando moldes de polidimemetilsiloxano (PDMS). Evaluamos una gama de geometrías de moldes para determinar las características más efectivas del molde. Los ECT en forma de malla con múltiples haces y uniones presentaban excelentes características en viabilidad celular, función de tejido y escalabilidad en comparación con formatos lineales o de hojas lisas que carecía de poros o uniones. Implantamos el ECT en forma de malla en un modelo de infarto de miocardio de rata y confirmamos sus efectos terapéuticos similares a los ECT cilíndricos implantados12. Aquí describimos el protocolo para generar un ECT en forma de malla derivado de hiPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tras la finalización de nuestra investigación de un formato lineal, derivado de hiPSC ECT5,adaptamos el protocolo para mezclar CM, EC y MC derivados de hiPSC para facilitar la expansión in vitro de las células vasculares dentro de las ECT y el posterior acoplamiento vascular in vivo entre las ECT y el miocardio receptor.
Para facilitar la generación de geometrías ECT de malla más grandes e implantables, utilizamos láminas delgadas de PDMS para diseñar los molde…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa de Investigación pediátrica del corazón de Kosair Charities en la Universidad de Louisville y el Proyecto Organoid en el CENTRO RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas. HiPSCs utilizados en nuestros protocolos publicados fueron proporcionados por el Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS, Universidad de Kioto, Kioto, Japón.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referencias
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