Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo
Summary
O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.
Abstract
O objetivo deste protocolo é visualizar hastes de actina intranucleares que se reúnem em embriões de melanogaster Drosophila vivos após estresse térmico. As hastes actina são uma marca registrada de uma Resposta ao Estresse Actin (ASR) conservada e indutível que acompanha patologias humanas, incluindo doenças neurodegenerativas. Anteriormente, mostramos que o ASR contribui para falhas de morfogênese e viabilidade reduzida do desenvolvimento de embriões. Este protocolo permite o estudo contínuo dos mecanismos subjacentes à montagem da haste actin e do ASR em um sistema modelo altamente favorável à imagem, genética e bioquímica. Os embriões são coletados e montados em uma tampa para prepará-los para injeção. A actina globular conjugada por rhodamina(G-actin Red) é diluída e carregada em uma microacela. Uma única injeção é feita no centro de cada embrião. Após a injeção, os embriões são incubados a temperatura elevada e as hastes de actina intranuclear são então visualizadas por microscopia confocal. A recuperação da fluorescência após experimentos de fotobleaching (FRAP) pode ser realizada nas hastes de actin; e outras estruturas ricas em actina no citoplasma também podem ser imagens. Descobrimos que o G-actinRed polimeriza como g-actina endógeno e não interfere, por si só, no desenvolvimento normal de embriões. Uma limitação deste protocolo é que deve-se tomar cuidado durante a injeção para evitar ferimentos graves no embrião. No entanto, com a prática, injetar G-actinRed em embriões de Drosophila é uma maneira rápida e confiável de visualizar hastes de actina e pode ser facilmente usada com moscas de qualquer genótipo ou com a introdução de outros estresses celulares, incluindo hipóxia e estresse oxidativo.
Introduction
Este protocolo descreve como injetar G-actinRed para visualizar a montagem de hastes de actina intranuclear em embriões estressados pelo calor que estão passando por uma Resposta de Estresse Actina indutível (ASR)1. Desenvolvemos este protocolo para auxiliar estudos do ASR, que em embriões leva à morfogênese interrompida e à viabilidade reduzida, e em tipos de células humanas adultas está associado a patologias incluindo insuficiência renal2,miopatias musculares3,e Alzheimer e Doença de Huntington4,5,6,7,8. Este ASR é induzido por numerosos estresses celulares, incluindo choque térmico9,10,11, estresse oxidativo4,6, síntese ATP reduzida12, e huntingtin anormal ou β-amilóide oligomerização4,5,6,7,9,13,14,15,16. Uma marca registrada do ASR é a montagem de hastes de actina aberrantes no citoplasma ou núcleo das células afetadas, que é impulsionada pela hiperativação induzida pelo estresse de uma proteína interativa de actina, Cofilin1,5,6,10. Infelizmente, permanecem as principais lacunas de conhecimento em relação ao ASR. Por exemplo, a função das hastes de actin não é conhecida. Não entendemos por que as hastes se formam no citoplasma de alguns tipos de células, mas o núcleo de outros. Também não está claro se o ASR é protetor ou mal adaptável para células ou embriões submetidos a estresse. Finalmente, ainda não sabemos os mecanismos detalhados subjacentes à hiperativação de Cofilin ou ao conjunto de hastes actin. Assim, este protocolo fornece um ensaio rápido e versátil para sondar o ASR visualizando a formação e dinâmica da haste actin no sistema experimental altamente tratável do embrião de mosca de fruta viva.
O protocolo para microinjetar G-actinRed em embriões Drosophila vivos foi inicialmente desenvolvido para estudar a dinâmica das estruturas normais de actina citoplasmática17 durante eventos de construção de tecidos. Nesses estudos, descobrimos que a injeçãovermelha G-actin não afetou negativamente os processos de desenvolvimento precoce no embrião, incluindo citocina ou gastraculação17,18. Em seguida, modificamos o protocolo, adaptando o manuseio de embriões e a injeçãovermelha G-actin para permitir a imagem de hastes de actina em embriões estressados pelo calor submetidos ao ASR1. Outros métodos além da injeção de G-actinRed podem ser usados para visualizar actina em embriões. Esses métodos dependem da expressão de proteínas fluorescentes (FPs) marcadas para atuar ou para domínios de proteínas de ligação de actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (revisada em19). No entanto, o uso dessas sondas FP requer cautela, pois podem estabilizar ou interromper algumas estruturas de actina, não rotular igualmente todas as estruturas actin20, e no caso de actin-GFP, são altamente superexpressas – problemáticas para a análise da montagem de haste que não só é dependente do estresse, mas também atua na concentração dependente1. Assim, g-actinred é a sonda preferida para estudos de vara em embriões de mosca, e o grande tamanho do embrião permite sua fácil injeção.
O fluxo de trabalho deste protocolo é semelhante a outras técnicas de microinjeção bem estabelecidas que têm sido utilizadas para injetar proteínas, ácidos nucleicos, drogas e indicadores fluorescentes nos embriões de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. No entanto, após a microinjeção do G-actinRed aqui, os embriões são expostos a um leve estresse térmico para induzir o conjunto de hastes de actina ASR e intranuclear. Para laboratórios com acesso a moscas e uma plataforma de injeção, este método deve ser facilmente implementável e adaptável para linhas específicas de estudo em relação ao ASR, incluindo sua indução por diferentes estresses ou modulação em diferentes origens genéticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A importância deste método é que utiliza o protocolo bem estabelecido de microinjeção em embriões Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para viabilizar novas pesquisas sobre o ASR e a montagem da haste actin. Uma grande vantagem de injetar G-actinRed em embriões vivos é…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem com gratidão o trabalho de Liuliu Zheng e Zenghui Xue, que ajudaram a pioneira nesta técnica no laboratório Sokac, bem como Hasan Seede, que ajudou na análise. O trabalho deste estudo é financiado por uma bolsa do NIH (R01 GM115111).
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
Referencias
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Biología del desarrollo. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, A., Cid-Arregui, A., García-Carrancá, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. . Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
