Fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base Janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches

Summary

L’objectif de ce protocole est de montrer l’assemblage d’une nanomatrix biomimétique (NM) avec des nanotubes de base Janus (JBNTs) et de la fibronectine (FN). Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs), les MR présentent une excellente bioactivité en encourageant l’adhérence hMSCs.

Abstract

Un NM biomimétique a été développé pour servir d’échafaudage biologique d’ingénierie tissulaire, qui peut améliorer l’ancrage des cellules souches. Le NM biomimétique est formé à partir de JBNTs et FN par auto-assemblage dans une solution aqueuse. Les JBNT mesurent de 200 à 300 μm de longueur avec des canaux creux hydrophobes intérieurs et des surfaces hydrophiliques extérieures. Les JBNT sont facturés positivement et les NF sont facturés négativement. Par conséquent, lorsqu’ils sont injectés dans une solution aqueuse neutre, ils sont collés entre eux par liaison non rentable pour former les faisceaux NM. Le processus d’auto-assemblage est terminé en quelques secondes sans aucun initiateur chimique, source de chaleur ou lumière UV. Lorsque le pH de la solution NM est inférieur au point isoélectrique des FN (pI 5.5-6.0), les faisceaux NM s’auto-libèrent en raison de la présence d’un FN chargé positivement.

NM est connu pour imiter la matrice extracellulaire (ECM) morphologiquement et, par conséquent, peut être utilisé comme un échafaudage injectable, qui fournit une excellente plate-forme pour améliorer l’adhérence hMSC. L’analyse de la densité cellulaire et les expériences d’imagerie par fluorescence ont indiqué que les MR augmentaient considérablement l’ancrage des HMC par rapport au contrôle négatif.

Introduction

Les cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs) ont montré le potentiel d’auto-renouvellement et d’auto-différenciation le long de différentes lignées mésenchymales, ce qui contribue à la régénération et à l’entretien des^{tissus 1}. Basé sur le potentiel de différenciation, hMSCs sont considérés comme candidats pour des dommages mésenchymal de tissu et thérapie hématopoietic^{de désordre 2.} HMSCs ont montré la capacité de favoriser la guérison des plaies en augmentant la réparation des tissus, l’angiogenèse, et la réduction de l’inflammation³. Toutefois, sans l’aide biochimique ou biomatériaux, l’efficacité pour les HMC d’atteindre un tissu cible et de fonctionner à l’endroit désiré est faible⁴. Bien que divers échafaudages d’ingénierie aient été utilisés pour attirer les HMSC à adhérer aux lésions, certains sites tels que la rupture de plaque de croissance, au milieu d’un os long, ne sont pas facilement accessibles par les échafaudages préfabriqués conventionnels, qui peuvent ne pas s’adapter parfaitement dans un emplacement blessé irrégulièrement formé.

Ici, nous avons développé un nanomatériau biomimétique qui peut s’auto-assembler in situ et être injecté dans une zone cible difficile à atteindre. Le bio-échafaudage injectable NM est composé de nanotubes de base Janus (JBNTs) et de fibronectine (FN). JBNTs, également connu sous le nom nanotubes rosette (RNTs), sont dérivés de paires de base d’ADN, en particulier la thymine et l’adénine,^{ici 5,6,7}. Comme on le voit dans la figure 1, les nanotubes sont formés lorsque six molécules des paires de base d’ADN dérivées s’auto-assemblent par liaisons hydrogène pour former un^{plan 6}. Six molécules sont ensuite empilées les unes sur les autres dans un plan via une forte interaction pi-empilage⁷, qui peut être jusqu’à 200-300 μm de longueur. Les JBNTs sont conçus pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN réagisse avec eux.

Le FN est une glycoprotéine adhésive à poids moléculaire élevé, que l’on retrouve dans la matrice extracellulaire (ECM)⁹. Ceux-ci peuvent jouer un rôle de médiateur dans l’attachement des cellules souches à d’autres composants de l’ECM, en particulier le^{collagène 10}. Nous avons conçu des JBNTs pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN puisse réagir avec eux pour former NM en quelques secondes par liaison noncovalente. Par conséquent, NM est un bio-échafaudage prometteur à injecter dans un site de fracture osseuse qui ne pouvait pas être accessible par les échafaudages fabriqués de façon conventionnelle. Ici, le NM injectable présente une excellente capacité à améliorer l’ancrage hMSC in vitro, présentant leur potentiel à servir d’échafaudage pour la régénération des tissus.

Protocol

1. Synthèse des JBNT REMARQUE : Le monomère JBNT a été préparé tel qu’il a étépublié précédemment 11. Synthèse du composé A1 Préparer une solution contenant 8,50 g d’acide 2-cyanoacétique et 9,80 g d’éthylcarbamate dans 25 mL de toluène et 2,5 mL de N, N-diméthylformamide. Ajouter 4,90 mL de chlorure de phosphoryl dans le sens de la goutte. Chauffer ensuite le mélange à 70 °C et continuer à remuer pendant 1,5 h. R…

Representative Results

Nos études ont découvert que la formation du NM des JBNT et du FN est rapide, ce qui s’est produit en 10 secondes. Comme le montre la figure 2,la floccule blanche a été obtenue lorsque la solution JBNT a été mélangée à la solution FN et pipetted à plusieurs reprises. Le processus de formation de NM est complètement biomimétique. Aucun stimulus externe n’est nécessaire. Le processus de fabrication est beaucoup plus facile que celui de certains biomatériaux émergents, qui es…

Discussion

Dans cette étude, nous avons développé un NM biomimétique auto-assemblé, qui a été formé avec des JBNTs inspirés de l’ADN et fn. Lors de la préparation de la solution JBNT, la poudre lyophilisée JBNT devrait être dissoute dans l’eau au lieu de PBS parce que PBS provoquera l’agglomération de JBNTs, ce qui inhibe leur assemblage. En outre, le NM devrait également être assemblé dans l’eau si nous voulons observer les structures nano-fibriles du NM, parce que le sel dans PBS se regroupera avec des fib…

Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056