Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

Summary

O objetivo deste protocolo é mostrar a montagem de uma nanomatrix biomimética (NM) com nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Quando co-cultivados com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), os NMs apresentam excelente bioatividade no incentivo à adesão dos HMSCs.

Abstract

Um NM biomimético foi desenvolvido para servir como um andaime biológico de engenharia tecidual, que pode melhorar a ancoragem de células-tronco. O NM biomimético é formado a partir de JBNTs e FN através de auto-montagem em uma solução aquosa. Os JBNTs medem 200-300 μm de comprimento com canais ocos hidrofóbicos internos e superfícies hidrofílicas externas. Os JBNTs são carregados positivamente e as FNs são cobradas negativamente. Portanto, quando injetados em uma solução aquosa neutra, eles são unidos através de laços não covalentes para formar os feixes NM. O processo de automontagem é concluído dentro de alguns segundos sem qualquer iniciador químico, fonte de calor ou luz UV. Quando o pH da solução NM for inferior ao ponto isoelétrico das FNs (pI 5.5-6.0), os feixes de NM serão auto-liberados devido à presença de FN carregado positivamente.

NM é conhecido por imitar a matriz extracelular (ECM) morfologicamente e, portanto, pode ser usado como um andaime injetável, que fornece uma excelente plataforma para melhorar a adesão do HMSC. A análise da densidade celular e os experimentos de imagem de fluorescência indicaram que os NMs aumentaram significativamente a ancoragem de hMSCs em comparação com o controle negativo.

Introduction

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) têm mostrado o potencial de auto-renovação e auto-diferenciação ao longo de diferentes linhagens mesenquimais, o que ajuda na regeneração e manutenção dos tecidos¹. Com base no potencial de diferenciação, os HMSCs são considerados candidatos a lesões de tecido mesenquimal e terapia de transtorno hematopoiético². hMSCs têm mostrado a capacidade de promover a cicatrização de feridas aumentando a reparação de tecidos, angiogênese e reduzindo a inflamação³. No entanto, sem assistência bioquímica ou biomaterial, a eficiência para que os hMSCs atinjam um tecido alvo e funcionem no local desejado é baixa⁴. Embora vários andaimes projetados tenham sido utilizados para atrair hMSCs para aderir às lesões, alguns locais como a fratura da placa de crescimento, no meio de um osso longo, não são facilmente acessíveis pelos andaimes convencionais pré-fabricados, que podem não se encaixar perfeitamente em um local lesionado de forma irregular.

Aqui, desenvolvemos um nanomaterial biomimético que pode se auto-montar in situ e ser injetado em uma área alvo de difícil acesso. O bioescato injetável NM é composto por nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Os JBNTs, também conhecidos como Nanotubos Rosette (RNTs), são derivados de pares de bases de DNA, especificamente timina e adenina, aqui^5,6,7. Como visto na Figura 1,os nanotubos são formados quando seis moléculas da base de DNA derivada se auto-montam através de ligações de hidrogênio para formar um plano⁶. Seis moléculas são então empilhadas uma sobre a outra em um plano através de uma forte interação pi-empilhamento⁷, que pode ser de até 200-300 μm de comprimento. Os JBNTs são projetados para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN reaja com elas.

FN é uma glicoproteína adesiva de alto peso molecular, que pode ser encontrada na matriz extracelular (ECM)⁹. Estes podem mediar a fixação de células-tronco a outros componentes do ECM, particularmente o colágeno¹⁰. Projetamos JBNTs para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN possa reagir com eles para formar NM em poucos segundos através de ligação não covalente. Portanto, nm é um promissor bioescato a ser injetado em um local de fratura óssea que não poderia ser acessível pelos andaimes convencionalmente fabricados. Aqui, o NM injetável apresenta uma excelente capacidade de melhorar a ancoragem hMSC in vitro, exibindo seu potencial para servir como um andaime para regeneração tecidual.

Protocol

1. Síntese de JBNTs NOTA: O monômero JBNT foi preparado conforme publicado anteriormente11. Síntese do composto A1 Prepare uma solução contendo 8,50 g de ácido 2-cianoacético e 9,80 g de etilcarbama em 25 mL de tolueno e 2,5 mL de N, N-dimetilformamida. Adicione 4,90 mL de cloreto de fósforo dropwise. Em seguida, aqueça a mistura a 70 °C e continue mexendo por 1,5 h. Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e despeje 10…

Representative Results

Nossos estudos descobriram que a formação do NM de JBNTs e FN é rápida, o que aconteceu em 10 segundos. Como mostrado na Figura 2,o flocule branco foi obtido quando a solução JBNT foi misturada com a solução FN e pipetada várias vezes. O processo de formação de NM é completamente biomimético. Não são necessários estímulos externos. O processo de fabricação é muito mais fácil do que o de alguns biomateriais emergentes, que são baseados em luz ultravioleta ou iniciador qu…

Discussion

Neste estudo, desenvolvemos um NM biomimético auto-montado, que foi formado com JBNTs inspirados em DNA e FN. Ao preparar a solução JBNT, o pó liofilizado JBNT deve ser dissolvido na água em vez de PBS, pois a PBS causará aglomeração de JBNTs, o que inibe sua montagem. Além disso, o NM também deve ser montado em água se quisermos observar as estruturas nanofibrilas do NM, pois o sal em PBS vai empacotar com fibras NM, o que pode reduzir muito a resolução das imagens.

O NM tem most…

Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056