L’objectif de ce protocole est de montrer l’assemblage d’une nanomatrix biomimétique (NM) avec des nanotubes de base Janus (JBNTs) et de la fibronectine (FN). Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs), les MR présentent une excellente bioactivité en encourageant l’adhérence hMSCs.
Un NM biomimétique a été développé pour servir d’échafaudage biologique d’ingénierie tissulaire, qui peut améliorer l’ancrage des cellules souches. Le NM biomimétique est formé à partir de JBNTs et FN par auto-assemblage dans une solution aqueuse. Les JBNT mesurent de 200 à 300 μm de longueur avec des canaux creux hydrophobes intérieurs et des surfaces hydrophiliques extérieures. Les JBNT sont facturés positivement et les NF sont facturés négativement. Par conséquent, lorsqu’ils sont injectés dans une solution aqueuse neutre, ils sont collés entre eux par liaison non rentable pour former les faisceaux NM. Le processus d’auto-assemblage est terminé en quelques secondes sans aucun initiateur chimique, source de chaleur ou lumière UV. Lorsque le pH de la solution NM est inférieur au point isoélectrique des FN (pI 5.5-6.0), les faisceaux NM s’auto-libèrent en raison de la présence d’un FN chargé positivement.
NM est connu pour imiter la matrice extracellulaire (ECM) morphologiquement et, par conséquent, peut être utilisé comme un échafaudage injectable, qui fournit une excellente plate-forme pour améliorer l’adhérence hMSC. L’analyse de la densité cellulaire et les expériences d’imagerie par fluorescence ont indiqué que les MR augmentaient considérablement l’ancrage des HMC par rapport au contrôle négatif.
Les cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs) ont montré le potentiel d’auto-renouvellement et d’auto-différenciation le long de différentes lignées mésenchymales, ce qui contribue à la régénération et à l’entretien destissus 1. Basé sur le potentiel de différenciation, hMSCs sont considérés comme candidats pour des dommages mésenchymal de tissu et thérapie hématopoieticde désordre 2. HMSCs ont montré la capacité de favoriser la guérison des plaies en augmentant la réparation des tissus, l’angiogenèse, et la réduction de l’inflammation3. Toutefois, sans l’aide biochimique ou biomatériaux, l’efficacité pour les HMC d’atteindre un tissu cible et de fonctionner à l’endroit désiré est faible4. Bien que divers échafaudages d’ingénierie aient été utilisés pour attirer les HMSC à adhérer aux lésions, certains sites tels que la rupture de plaque de croissance, au milieu d’un os long, ne sont pas facilement accessibles par les échafaudages préfabriqués conventionnels, qui peuvent ne pas s’adapter parfaitement dans un emplacement blessé irrégulièrement formé.
Ici, nous avons développé un nanomatériau biomimétique qui peut s’auto-assembler in situ et être injecté dans une zone cible difficile à atteindre. Le bio-échafaudage injectable NM est composé de nanotubes de base Janus (JBNTs) et de fibronectine (FN). JBNTs, également connu sous le nom nanotubes rosette (RNTs), sont dérivés de paires de base d’ADN, en particulier la thymine et l’adénine,ici 5,6,7. Comme on le voit dans la figure 1, les nanotubes sont formés lorsque six molécules des paires de base d’ADN dérivées s’auto-assemblent par liaisons hydrogène pour former unplan 6. Six molécules sont ensuite empilées les unes sur les autres dans un plan via une forte interaction pi-empilage7, qui peut être jusqu’à 200-300 μm de longueur. Les JBNTs sont conçus pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN réagisse avec eux.
Le FN est une glycoprotéine adhésive à poids moléculaire élevé, que l’on retrouve dans la matrice extracellulaire (ECM)9. Ceux-ci peuvent jouer un rôle de médiateur dans l’attachement des cellules souches à d’autres composants de l’ECM, en particulier lecollagène 10. Nous avons conçu des JBNTs pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN puisse réagir avec eux pour former NM en quelques secondes par liaison noncovalente. Par conséquent, NM est un bio-échafaudage prometteur à injecter dans un site de fracture osseuse qui ne pouvait pas être accessible par les échafaudages fabriqués de façon conventionnelle. Ici, le NM injectable présente une excellente capacité à améliorer l’ancrage hMSC in vitro, présentant leur potentiel à servir d’échafaudage pour la régénération des tissus.
Dans cette étude, nous avons développé un NM biomimétique auto-assemblé, qui a été formé avec des JBNTs inspirés de l’ADN et fn. Lors de la préparation de la solution JBNT, la poudre lyophilisée JBNT devrait être dissoute dans l’eau au lieu de PBS parce que PBS provoquera l’agglomération de JBNTs, ce qui inhibe leur assemblage. En outre, le NM devrait également être assemblé dans l’eau si nous voulons observer les structures nano-fibriles du NM, parce que le sel dans PBS se regroupera avec des fib…
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux sont soutenus financièrement par les NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) et l’Université du Connecticut.
1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
96-well plate | Corning | 353072 | |
absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
silica gel | TCI America | S0821 | |
sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |