Modélisation de l’infection par le virus de l’hépatite B dans les cellules non hépatiques 293T-NE-3NRs
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) dans de nouvelles cellules 293T (293T-NE-3NR, exprimant des NTCP humains, HNF4α, RXRα et PPARα) et des cellules hépatiques traditionnelles (PleG2-NE, exprimant le NTCP humain).
Abstract
Le VHB infecte principalement les hépatocytes humains, mais il a également été trouvé pour infecter les tissus extrahépatiques tels que les reins et les testicules. Néanmoins, les modèles de VHB à base de cellules sont limités aux lignées cellulaires d’hépatome (comme HepG2 et Huh7) surexprimant un récepteur fonctionnel du VHB, le polypeptide co-transport du taurocholate de sodium (NTCP). Ici, nous avons utilisé 293T-NE-3NRs (293T surexprimant NTCP humain, HNF4α, RXRα et PPARα) et HepG2-NE (HepG2 surexprimant NTCP) comme lignées cellulaires de modèle. L’infection par le VHB dans ces lignées cellulaires a été effectuée soit en utilisant des particules concentrées du virus du VHB provenant d’HepG2.2.15, soit en co-organisant des hepG2.2.15 avec les lignées cellulaires cibles. L’immunofluorescence de HBcAg pour HBcAg a été exécutée pour confirmer l’infection de VHB. Les deux méthodes présentées ici nous aideront à étudier l’infection par le VHB dans les lignées cellulaires non hépatiques.
Introduction
L’hépatite B affecte la vie de plus de 2 milliards de personnes et constitue l’une des principales menaces pour la santé publique. Environ 257 millions de personnes sont infectées de façon chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) dans le monde, ce qui représente un lourd fardeau pour la société1. Les hépatocytes ne sont pas les seules cellules infectées par le VHB et d’autres cellules dans les tissus non hépatiques, comme les reins et les testicules, sont également infectées par ce virus2,3. À l’heure actuelle, les modèles de cellules d’infection par le VHB sont limités aux hépatocytes humains avec seulement peu de modèles de lignée cellulaire non hépatique. Cela entrave l’étude de l’infection par le VHB et de la pathologie liée au VHB des tissus non hépatiques. Ici, nous présentons des protocoles pour étudier l’infection par le VHB dans les cellules non hépatiques 293T ainsi que dans les cellules à base d’hépatome.
Le polypeptide de co-transport du taurocholate de sodium (NTCP) est un récepteur fonctionnel de l’hépatite B humaine et du virus de l’hépatite D4. Le facteur nucléaire hépatocyte 4α (HNF4α), le récepteur X rétinoïde α (RXRα) et le récepteur α (PPARα) activé par proliférateur peroxisome sont des facteurs de transcription enrichis en foie qui limitent le tropisme viral du VHB. Ils ont été vérifiés pour promouvoir la synthèse prégénomique de l’ARN du VHB et soutenir la réplication du VHB dans une ligne de cellules non hépatomes5. Nous avons construit trois lignées cellulaires différentes, des lignées cellulaires HepG2 exprimant NTCP (HepG2-NE), une lignée cellulaire 293T exprimant NTCP (293T-NE) et une lignée cellulaire 293T exprimant quatre gènes hôtes; NTCP, HNF4α, RXRα et PPARα (293T-NE-3NR). Deux méthodes d’infection par le VHB ont été développées sur la base de 293T-NE-3NR (figure 1). La première méthode utilise l’inoculation dans 293T-NE-3NR avec une équivalence élevée du génome viral (GEq élevé (150), DMSO et PEG8000) pendant 24 h. La deuxième méthode utilise la co-culture 293T-NE-3NRs avec HepG2.2.15, qui peut produire des particules de VHB (faible GEq (environ 1,83) sans DMSO et PEG8000), imitant ainsi étroitement les conditions naturelles.
Les cellules hepG2.2.15 sont dérivées de la lignée HepG2 et sécrètent chroniquement le VHB infectieux, ainsi que les particules subvirales dans le milieu de culture6,7. La cyclosporine A (CsA) est un immunosuppresseur cliniquement utilisé pour la suppression du rejet de xénogreffe. Des études ont montré que le CsA inhibe l’entrée du VHB dans les hépatocytes cultivés en inhibant l’activité du transporteur du NTCP et en bloquant la liaison du NTCP aux protéines de grande enveloppe8.
Les cellules d’hepG2-NE ont été employées comme commande positive tandis que les cellules traitées de CsA ont été employées comme contrôle négatif. En comparant avec les groupes témoins positifs et négatifs, nous pouvons savoir quels gènes hôtes jouent un rôle critique dans l’infection par le VHB. En outre, grâce à ce mode d’infection par le VHB, nous pouvons également trouver d’autres mécanismes nouveaux ou des gènes hôtes impliqués dans l’infection par le VHB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous introduisons des protocoles pour l’infection par le VHB dans les cellules 293T-NE-3NR non hépatiques et les cellules hepG2-NE à base d’hépatome. 293T-NE-3NRs étaient appropriés pour l’infection de VHB à la fois haut et bas GEq. Les étapes critiques suivantes doivent être prises en considération lors de l’utilisation de notre protocole. Le statut cellulaire est un facteur important pour une infection réussie. Le milieu d’infection doit être modifié en temps opportun après la période initi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (no 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (no 81571994 à P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (no 81950410640 à W.I.); La Fondation de l’Université Li Ka Shing Shantou (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le Professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
Referencias
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