Modelado de la infección por el virus de la hepatitis B en células no hepáticas 293T-NE-3R
Summary
Este manuscrito describe un protocolo detallado para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en células 293T de ingeniería novedosa (293T-NE-3NR, expresando NTCP humano, HNF4, RXR y PPAR) y células hepáticas tradicionales (HepG2-NE, expresando NTCP humano).
Abstract
El VHB infecta principalmente a los hepatocitos humanos, pero también se ha encontrado para infectar tejidos extrahepáticos como el riñón y los testículos. No obstante, los modelos de VHB basados en células se limitan a líneas celulares de hepatoma (como HepG2 y Huh7) que sobreexpresan un receptor funcional del VHB, polipéptido de cocarvamiento de taurocholato sódico (NTCP). Aquí, usamos 293T-NE-3NRs (293T sobreexpresando NTCP humano, HNF4, RXR y PPAR) y HepG2-NE (HepG2 sobreexpresando NTCP) como líneas celulares modelo. La infección por VHB en estas líneas celulares se realizó utilizando partículas concentradas del virus del VHB de HepG2.2.15 o co-cultivo de HepG2.2.15 con las líneas celulares diana. Se realizó inmunofluorescencia HBcAg para HBcAg para confirmar la infección por VHB. Los dos métodos presentados aquí nos ayudarán a estudiar la infección por VHB en líneas celulares no hepáticas.
Introduction
La hepatitis B afecta la vida de más de 2.000 millones de personas y es una de las principales amenazas para la salud pública. Aproximadamente 257 millones de personas están infectadas crónicamente con el virus de la hepatitis B (VHB) en todo el mundo, causando una gran carga a la sociedad1. Los hepatocitos no son las únicas células infectadas por el VHB y otras células en el tejido no hepático, como el riñón y los testículos, también están infectadas por este virus2,,3. Actualmente, los modelos de células de infección por VHB se limitan a hepatocitos humanos con solo unos pocos modelos de líneas celulares no hepáticas. Esto dificulta el estudio de la infección por vhB y la patología relacionada con el VHB de tejidos no hepáticos. Aquí presentamos protocolos para estudiar la infección por VHB en células 293T no hepáticas, así como en células basadas en hepatoma.
El polipéptido de cocarholato de tauriconato de sodio (NTCP) es un receptor funcional para el virus de la hepatitis B y la hepatitis D humana4. El factor nuclear de hepatocitos 4o (HNF4), el receptor X de retinoide (RXR) y el receptor activado por proliferador peroxisoma (PPAR) son factores de transcripción enriquecidos por el hígado que restringen el tropismo viral del VHB. Se han verificado para promover la síntesis de ARN pregenómico del VHB y apoyar la replicación del VHB en una línea celular no hepatoma5. Construimos tres líneas celulares diferentes, líneas celulares HepG2 que expresan NTCP (HepG2-NE), línea celular 293T que expresa NTCP (293T-NE) y línea celular 293T que expresa cuatro genes huésped; NTCP, HNF4, RXR y PPAR (293T-NE-3NRs). Se desarrollaron dos métodos para la infección por vhPH basados en 293T-NE-3NRs(Figura 1). El primer método utiliza la inoculación en 293T-NE-3NR con alta equivalencia del genoma viral (GEq (150), DMSO y PEG8000) durante 24 h. El segundo método emplea el co-cultivo 293T-NE-3NR con HepG2.2.15, que puede producir partículas de VHB (GEq bajo (alrededor de 1.83) sin DMSO y PEG8000), emulando así estrechamente las condiciones naturales.
Las células HepG2.2.15 se derivan de la línea HepG2 y secretan crónicamente el VHB infeccioso, así como partículas subvirales en el medio de cultivo6,,7. La ciclosporina A (CsA) es un inmunosupresor utilizado clínicamente para la supresión del rechazo del xenoinjerto. Los estudios han demostrado que CsA inhibe la entrada del VHB en los hepatocitos cultivados al inhibir la actividad del transportador de NTCP y bloquear la unión de NTCP a proteínas de envoltura grande8.
Las células HepG2-NE se utilizaron como control positivo, mientras que las células tratadas con CsA se utilizaron como control negativo. En comparación con los grupos de control positivos y negativos, podemos averiguar qué genes del huésped desempeñan un papel crítico en la infección por el VHB. Además, a través de este modo de infección por el VHB, también podemos encontrar otros mecanismos novedosos o genes de huésped implicados en la infección por el VHB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, introducimos protocolos para la infección por VHB en células No hepáticas 293T-NE-3NR y HepG2-NE basadas en hepatoma. 293T-NE-3NR eran adecuados para la infección por VHB tanto en GEq alto como bajo. Los siguientes pasos críticos deben tenerse en cuenta al utilizar nuestro protocolo. El estado celular es un factor importante para una infección exitosa. El medio de infección debe cambiarse oportunamente después del período inicial de infección por VHB. Las células 293T-NE-3NRs son típicamente frágiles …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No 81870432 y 81570567 a X.L.Z.), (No. 81571994 a P.N.S.), Fondo de Investigación para Jóvenes Científicos Internacionales (No 81950410640 a W.I.); La Fundación Universitaria Li Ka Shing Shantou (No. L1111 2008 a P.N.S.). Nos gustaría dar las gracias al profesor Stanley Lin de Shantou University Medical College por sus consejos útiles.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
Referencias
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