Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique humain et les lymphocytes T CD4+ de patients atteints du syndrome de Sézary pour le profilage transcriptomique

Summary

Nous présentons un protocole simple pour l’isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique du sang total obtenu chez des patients diagnostiqués avec le syndrome de Sézary, suivi de la sélection des lymphocytes T CD4+, de leur stimulation par phorbol12-myristate13-acétate et ionophore A23187, et de la préparation de l’ARN pour le profilage transcriptomique.

Abstract

Les lymphomes cutanés à cellules T (LTC) sont dérivés de la transformation et de la prolifération incontrôlée des lymphocytes T matures de la peau, et les mycoses fongoïdes (MF) et le syndrome de Sézary (SS) représentent les sous-types les plus courants. Malgré un certain nombre d’études sur la caractérisation de l’expression des gènes, des altérations génétiques et des anomalies épigénétiques du LTC, la pathogenèse moléculaire de la MF/ SS reste incertaine. MF se réfère au CTCL le plus commun avec une prédominance cutanée, et est généralement limité à la peau, tandis que SS est une variante leucémique agressive de CTCL avec une atteinte cutanée généralisée et se caractérise par une distribution néoplasique impliquant principalement le sang, la peau et les ganglions lymphatiques. En mettant l’accent sur la pratique clinique, l’identification de biomarqueurs d’expression génique a un énorme potentiel pour améliorer le diagnostic et le traitement de la MF / SS. En effet, des études transcriptomiques récentes ont identifié des biomarqueurs diagnostiques potentiels à partir de différences dans l’expression des gènes entre les lymphocytes T normaux et malins, ce qui pourrait améliorer notre compréhension de la biologie SS et révéler des cibles thérapeutiques potentielles. Ce manuscrit décrit un protocole reproductible détaillé pour l’isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique du sang total frais de patients diagnostiqués avec SS, la sélection de lymphocytes T à mémoire CD4+ (lymphocytes T CD4+CD45RO+), la stimulation chimique et la préparation d’ARN adaptés au profilage transcriptomique afin de découvrir de nouveaux marqueurs moléculaires pronostiques pour obtenir des informations supplémentaires sur l’étiologie de la maladie. La stimulation à l’aide d’agonistes chimiques pour activer la régulation nucléaire fournit une évaluation plus spécifique des voies importantes dans la régulation dynamique de la transcription et l’expression des gènes et élimine les défauts de confusion qui peuvent résulter de défauts de signalisation en amont résultant de la perte d’antigène TCR au niveau de la membrane cellulaire. Les données obtenues à partir de la comparaison du transcriptome des lymphocytes T SS non stimulés démasquent les défauts d’expression génique régulateurs fonctionnels qui ne sont pas évidents lors de l’analyse des cellules non stimulées quiescentes. En outre, la méthode décrite à partir de cette approche peut être adaptée pour étudier les défauts d’expression des gènes des lymphocytes T dans d’autres maladies immunitaires des lymphocytes T.

Introduction

Le lymphome T cutané (LTC), y compris les sous-types les plus courants de mycose fongoïde (MF) et de syndrome de Sézary (SS), est un groupe hétérogène de maladies dérivées de la transformation et de la prolifération incontrôlée de lymphocytes T matures de la peau ^1,2. Les lymphocytes T néoplasiques ont un CD4+CD45RO+ mature, un phénotype^{mémoire 3}, et expriment des marqueurs d’adhésion cutanée, augmentant l’épidermotropisme⁴, qui se manifeste par une éruption cutanée, en particulier au début de la maladie. L’évolution clinique de la MF est souvent indolente lorsqu’elle est soumise à des soins gérés de routine, mais un sous-ensemble de patients peut évoluer vers une maladie plus avancée. Dans ces cas de MF, les lésions cutanées se développent et s’épaississent en grosses tumeurs, et les lymphocytes T néoplasiques peuvent se disséminer aux ganglions lymphatiques et aux organes viscéraux. En revanche, le SS est une variante leucémique plus agressive du CTCL⁵, caractérisée par une triade de symptômes: érythrodermie généralisée (définie comme affectant >80% de la surface corporelle totale), lymphadénopathie et présence de plus de 1000/mm³ de lymphocytes T clonaux atypiques circulants avec des noyaux cérébriformes, appelés cellules de Sézary ^6,7 . Le pronostic pour les patients atteints de SS est significativement pire que celui des patients atteints de MF. La SS est rare avec un taux d’incidence de 0,1/100 000 et représente environ 3 % du total des cas de ^{LTC 8,9}. Le LTC se présente généralement chez les personnes âgées ayant un âge médian d’environ 60 ans¹⁰. Le taux d’incidence du LTC avait augmenté et, bien que la cause ne soit pas claire, le taux s’est stabilisé depuis 1998^11,12.

La pathogenèse moléculaire de la SS reste incertaine. Les études génétiques, épigénétiques et d’expression génique ont produit une multitude de données nouvelles, mais il reste des résultats incohérents, principalement en raison des petites cohortes de patients étudiées², ainsi que des différences dans la conception expérimentale et les populations témoins^13,14. L’amélioration de la caractérisation génomique et transcriptomique peut éclairer à la fois les mécanismes de la maladie et les cibles thérapeutiques jusque-là inexplorées. Par conséquent, d’autres études provenant d’une plus grande population de patients sont nécessaires pour mieux comprendre cette malignité hétérogène. Les panels de biomarqueurs qui sont très sensibles et spécifiques dans une cohorte SS ont obtenu des résultats moins uniformes dans d’autres cohortes¹⁵, ce qui représente un obstacle sérieux au développement de biomarqueurs diagnostiques et pronostiques fiables pour SS¹⁶. Les biomarqueurs diagnostiques idéaux seront systématiquement et fortement surexprimés dans les lymphocytes T malins, alors qu’ils seront absents ou presque absents dans les lymphocytes T normaux¹⁷. La découverte de biomarqueurs spécifiques à la maladie est importante pour l’avancement des protocoles diagnostiques et thérapeutiques pour la SS.

Des données transcriptomiques de haute qualité pour les lymphocytes T malins et normaux nécessitent une approche efficace et fiable de la préparation des échantillons. Ici, nous discuterons d’une stratégie détaillée mais simple pour obtenir des échantillons d’ARN à partir de populations de lymphocytes T pertinents pour les SS. Nous discuterons de l’isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) du sang total, de la sélection magnétique négative des populations de lymphocytes T CD4+CD45RO+ pertinents pour la maladie, de l’activation chimique pour révéler les différences dans les réponses fonctionnelles et de la préparation de l’ARN pour le profilage transcriptomique. Dans le protocole actuel, l’activation chimique a été réalisée à l’aide d’acétate de myristate de phorbol (PMA) et d’ionophore de calcium (^A23187)18,19, car des études antérieures ont montré une signalisation défectueuse des récepteurs des lymphocytes T dans le LTC, et la stimulation par PMA/A23187 contourne le récepteur des cellules T^20,21. En outre, PMA / A23187 permet une activation proximale plus directe des signaux nucléaires nécessaires à l’activation du gène des cytokines. Enfin, la stimulation des lymphocytes T fournit un niveau supplémentaire de compréhension de la régulation de l’expression des gènes qui ne pourrait pas être obtenu à partir des lymphocytes T au repos où le changement dynamique est absent.

Protocol

Les cellules humaines sont potentiellement infectieuses. Par conséquent, les expériences sont effectuées strictement conformément aux précautions et procédures requises discutées comme l’administration de la sécurité et de la santé au travail (OSHA) et l’équipement de protection individuelle (EPI). 1. Isolement des PBMC du sang total Recueillez tous les matériaux nécessaires du tableau 1 et amenez-les à température ambiante (RT). RP10F chaud à 37 °C. Ajuster la centrifugeuse à RT. À l’exception des centrifugations et du comptage des cellules, effectuez toutes les étapes à l’aide de cellules viables dans une armoire de sécurité biologique. Obtenir du sang dans cinq tubes de 10 mL (quantité souhaitée) contenant de l’anticoagulant. Conserver le sang total à température ambiante (18\u201224 °C). Étiqueter les tubes de séparation de 50 mL avec le numéro du sujet de recherche humain pour l’échantillon de sang à traiter. Transférer 10\u201215 mL de sang dans chaque tube de séparation avec le numéro de sujet correspondant. Diluer le sang au moins 2 fois avec la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank. Ne pas dépasser 35 mL de sang dilué par tube. Sous-couchez soigneusement et lentement le sang avec ~ 13 mL de milieu de densité. Surveillez à travers le milieu de densité transparent au fond du tube et arrêtez de pipeter lorsque la pipette est presque vide (pour éviter la libération de bulles). Retirez soigneusement la pipette pour éviter de mélanger les couches de sang et de milieu de densité. Transférez soigneusement les tubes de séparation remplis à la centrifugeuse sans perturber les couches. Centrifuger à 500 x g pendant 30 min avec le frein de la centrifugeuse éteint (décélération réglée à zéro).REMARQUE: Si la centrifugeuse n’affiche que le régime, consultez les spécifications du rotor pour estimer l’équivalent du régime pour 500 x g. Retirez soigneusement les tubes de séparation de la centrifugeuse sans perturber les couches. Observez le pelage bouffant, qui s’est formé entre le milieu de densité et les couches de plasma. Pipette par le haut pour enlever et jeter la majeure partie de la fraction plasma supérieure, de sorte que 10 mL restent au-dessus de la couche bouffante. Collectez soigneusement et lentement le pelage bouffant. Transférer les couches bouffantes de deux tubes de séparation dans un nouveau tube pré-étiqueté et stérile de 50 mL, comme le montre la figure 1. Diluer les PBMC au moins 2 fois avec HBSS, en portant le volume dans chaque nouveau tube jusqu’à 50 mL. N’oubliez pas de mettre le frein de la centrifugeuse à plein. PBMC en granulés par centrifugation à 400 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant autant que possible et tapotez le fond du tube pour desserrer la pastille. Pour lyser les globules rouges résiduels (GR), remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans 1 0,20122 mL de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) par 10 mL de volume sanguin initial. Incuber pendant exactement 5 min. Arrêtez rapidement la lyse avec un volume égal ou supérieur de HBSS et réglez le volume à 50 mL. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et tapotez le fond du tube pour desserrer la pastille de cellule. Mettre en commun les cellules du même donneur. Portez le volume jusqu’à 50 mL avec HBSS. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et tapotez le fond du tube pour desserrer la pastille de cellule. Resuspendez les cellules dans 10 mL de milieu RP10F chaud et prenez une aliquote pour un comptage cellulaire viable à l’aide du bleu de trypan. Calculez le nombre total de cellules dans chaque échantillon à l’aide d’un hémocytomètre. 2. Purification des lymphocytes T CD4+CD45RO+ des PBMC REMARQUE: La purification des lymphocytes T CD4+CD45RO+ des PBMC se fait en utilisant la séparation magnétique disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) avec des modifications mineures. Il est préférable de suivre le manuel du kit pour le temps d’incubation car chaque kit commercial a ses propres instructions. Lavez la quantité souhaitée de PBMC dans 10 mL de tampon de sélection. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et tapotez le fond du tube pour desserrer la pastille. Diluer les PBMC à 5 x 107 cellules/mL dans un tampon de sélection et les transférer dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL (12 x 75 mm). Ajouter 50 μL de cocktail d’anticorps par 1 mL d’échantillon et mélanger doucement. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Immédiatement avant utilisation, vortex de particules magnétiques pendant 30 secondes à grande vitesse. Ajouter 50 μL de particules magnétiques par 1 mL d’échantillon dans le tube contenant des PBMC et mélanger doucement. Porter le volume jusqu’à 2,5 mL avec le tampon de sélection et mélanger doucement. Placez le tube (sans couvercle) dans l’aimant et incubez à RT pendant 2,5 min. Prenez l’aimant et, dans un mouvement continu, inversez l’aimant et le tube pour verser la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube stérile. Pour augmenter la récupération, ajoutez 2,5 mL de tampon de sélection au tube restant dans l’aimant, sans perturber les billes immobilisées. Gardez dans l’aimant pendant encore 2,5 minutes et répétez l’étape 2.6 pour récupérer des cellules supplémentaires. Prenez une aliquote pour un comptage cellulaire viable en utilisant le bleu de trypan. Calculez le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules. Confirmer la pureté par cytométrie en flux (Figure 3). 3. Activation chimique Ajuster les lymphocytes T CD4+CD45RO+ à 5 x 106 cellules/mL avec un milieu RP10F chaud et répartir les cellules dans des boîtes de culture de la taille souhaitée. Reposer les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C 5 % de CO2 pendant la nuit. Cellules reposées en granulés par centrifugation à 400 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et tapotez le fond du tube pour desserrer la pastille de cellule. Ajuster la concentration de la cellule à 5 x 106 cellules / mL avec un milieu RP10F chaud et distribuer 0,5 \ 20121 x 107 cellules dans chacun de trois tubes stériles à bouchon à vis.REMARQUE: Si suffisamment de cellules sont disponibles, des stimulations en double ou des points de temps supplémentaires peuvent être inclus dans la conception expérimentale. Stimuler les cellules dans les tubes 2 et 3 avec PMA et A23187. Ajouter le PMA à 25 ng/mL et l’A23187 à 500 ng/mL et mélanger doucement. Ajouter un volume égal de diméthylsulfoxyde (DMSO) aux cellules du tube 1 qui servira de véhicule (contrôle). Par exemple, si vous utilisez 1 μL de PMA et 1 μL d’A23187, ajoutez 2 μL de DMSO au tube du véhicule. Maintenir la concentration finale de DMSO en dessous de 0,5 % dans tous les tubes. Desserrer les bouchons des tubes et renvoyer les cellules dans l’incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 pendant 2 h (tube 2) et 6 h (tubes 1 et 3). Au moment indiqué, centrifuger les cellules à 500 x g pendant 10 min. Avant la lyse, jetez autant de surnageant que possible, sans perturber la pastille cellulaire. Lysez rapidement les cellules, conformément aux instructions du kit d’isolement de l’ARN disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux). Procéder à l’isolement de l’ARN ou congeler le lysat à -80 °C pour le traiter plus tard avec des échantillons supplémentaires.REMARQUE: La pureté et l’intégrité de l’ARN peuvent être vérifiées à l’aide de l’électrophorèse microcapillaire. Facultatif : Pour éliminer complètement toutes les traces d’ADN de l’échantillon d’ARN purifié, utilisez un kit de nettoyage de l’ARN (voir tableau des matériaux), conformément aux instructions du fabricant.

Representative Results

Ce protocole comprend des procédures pour l’isolement des PBMC du sang SS, la purification des lymphocytes T CD4+CD45RO+ par sélection négative, la stimulation des lymphocytes T purifiés et l’isolement de l’ARN total pour le profilage transcriptomique. La figure 1 décrit le processus d’isolement du PBMC du sang total. Veuillez noter que le rendement total des PBMC SS variera en fonction du volume sanguin initial et de la charge tumorale circulante de chaque patient. Dans notre laboratoire, le rendement moyen des PBMC SS était de 4,6 × 106 cellules/mL de sang total (1,85 × 106 – 3,25 x 107 cellules/mL pour 7 SS). La viabilité moyenne des PBMC isolés était de 95\u201299%. La figure 2 montre la pureté et la viabilité élevées des lymphocytes T mémoire CD4+CD45RO+ sélectionnés. Le rendement moyen des lymphocytes T CD4+CD45RO+ provenant des PBMC SS était de 75 % (75,6 % – 84 %), comparativement à 15,9 % (3 % – 30 %) des PBMC de donneurs normaux (ND) obtenus à partir de chambres du système de leucoréduction (LRS). La viabilité et la pureté des lymphocytes T CD4+CD45RO+ obtenus par ce protocole de sélection négative ont été constamment élevées (Figure 3). Nous avons précédemment combiné le protocole d’activation ci-dessus avec des microréseaux pour étudier les changements fonctionnels dans les transcriptomes des cellules T SS et ND, et avons démontré que les cellules T mémoire SS et les PBMC SS expriment mal les cytokines et autres gènes de réponse immunitaire par rapport aux cellules T ND et aux PBMC 19,22,23. La figure 4 montre l’activation robuste de plusieurs gènes de cytokines, y compris IL4, IL 10, IL13 et IL22 dans les cellules T ND, mais pas dans les cellules T SS. Ce défaut dans l’expression fonctionnelle des gènes dans les lymphocytes T SS a depuis été confirmé par d’autres groupes24. En outre, de nombreux gènes qui ne sont normalement pas exprimés dans les cellules T ND sont fortement exprimés dans les cellules T SS, à la fois au repos et après stimulation (Figure 4). Il s’agit notamment des gènes de biomarqueurs SS DNM3, PLS3, TOX et TWIST1 25,26,27 décrits précédemment, ainsi que ANK1 et SGCE, qui ont été signalés pour la première fois par notre groupe. Ces biomarqueurs positifs sont fortement exprimés en SS, mais pas en ND, et évitent les pièges techniques associés aux biomarqueurs négatifs. Figure 1 : Isolement du PBMC dans le sang total. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Sélection négative de lymphocytes T mémoire CD4+ à partir de PBMC isolés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : La pureté des lymphocytes T CD4+CD45RO+ a été confirmée par cytométrie en flux. Les lymphocytes ont été fermés par diffusion de lumière (A), les lymphocytes vivants ont exclu le colorant de viabilité eFluor780 (B) et (C) représente des donneurs normaux (ND) non sélectionnés. La sélection négative a entraîné des populations presque pures de lymphocytes T CD45RO+ chez les patients atteints de ND (D) et de SS (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Expression génique différentielle dans les lymphocytes T mémoire CD4+CD45RO+ au repos et activés à partir de SS et de ND. L’expression génique z-score est représentée par une échelle de couleurs allant du rouge (expression élevée) au vert (expression faible). Les barres colorées en haut de la carte thermique représentent les traitements cellulaires : simulé/véhicule traité (rouge), 2 h stimulé (bleu) et 6 h stimulé (jaune). Plusieurs gènes de biomarqueurs SS sont fortement exprimés et les gènes de cytokines sont mal exprimés dans les cellules T SS par rapport aux cellules T ND. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Réactifs Milieu de densité Milieu de séparation lymphocytaire, Ficoll-Hypaque, ou milieu de densité équivalente avec densité = 1,077-1,080g/ml à 20oC. LE 1x solution saline équilibrée de Hank, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2 RP10F Milieu RPMI 1640, sérum fœtal bovin inactivé à 10 % par la chaleur, 1x solution de pénicilline-streptomycine, pH 7,2 Tampon de lyse ACK 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Pas besoin d’ajuster le pH. Il devrait être ~ 7.3. Tampon de sélection 1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA phorbol12-myristate13-acétate (PMA) 50 μg/ml dans le DMSO A23187 ionophore 500 μg/ml dans le DMSO Tableau 1 : Réactifs.

Discussion

Plusieurs façons d’isoler les PBMC ont été développées, et chacune a ses propres avantages et limites²⁸. Nous recueillons régulièrement jusqu’à 50 mL de sang dans cinq tubes de 10 mL contenant de l’anticoagulant. Le volume de sang pour l’isolement du PBMC dépend de plusieurs facteurs tels que la santé et l’âge du sujet de recherche ainsi que de l’expertise phlébotomiste. Une étape procédurale critique du protocole est la formation du gradient de pas. Une mauvaise stratification peut entraîner une défaillance partielle ou complète des PBMC dans les sédiments à l’interface. Nous préférons la méthode de sous-couche décrite ici, car il est facile de démarrer la couche inférieure. Pour distribuer complètement tout le milieu de densité sous le sang, il est essentiel d’utiliser une aide pipet sans fuite d’air. La contamination de la fraction PBMC par des types de cellules indésirables peut être minimisée par une collecte minutieuse et cohérente de la couche bouffante, qui doit être effectuée de la même manière pour chaque isolement. Si les PBMC ne sont pas fractionnés davantage, il faut éviter de collecter différentes quantités du gradient de densité et des couches plasmatiques entre les isolements. La lyse des globules rouges est effectuée pour minimiser l’impact potentiel de la contamination de l’ARN dérivé des globules rouges et des réticulocytes sur les analyses d’expression génique en aval. La lyse hypotonique sera inhibée par un excès de tampon isotonique.

Une isolation plus poussée du sous-ensemble des lymphocytes T est importante pour les études moléculaires. Ici, nous avons décrit la sélection ultérieure des lymphocytes T CD4+CD45RO+ par sélection négative pour éliminer les types de cellules indésirables. La sélection négative repose sur des anticorps reconnaissant des marqueurs de surface cellulaire spécifiques pour toutes les cellules indésirables. Les cellules enrobées d’anticorps sont ensuite éliminées par des billes magnétiques. Ce protocole de sélection élimine les cellules indésirables tout en permettant aux cellules cibles intactes et non stimulées de rester flottantes, ce qui est essentiel dans l’étude de l’activation des gènes. Cependant, il faut prendre soin d’éviter les amas cellulaires, qui réduisent la pureté finale des lymphocytes T CD4+ CD45RO+ sélectionnés. L’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) présent dans le tampon de sélection minimise l’agglutination cellulaire. Le rendement des lymphocytes T dépend de facteurs tels que le volume initial du sang, les variables du patient telles que le traitement administré au patient et le stade de la maladie au moment du prélèvement de l’échantillon. Le traitement administré aux patients peut également affecter la viabilité cellulaire. De plus, le prélèvement d’échantillons avant toute procédure telle que la photophérèse a également un impact positif sur la pureté des lymphocytes T CD4+CD45RO+. Nous avons observé que le prélèvement d’échantillons après la procédure de traitement par photophérèse a un impact négatif sur le rendement des lymphocytes T CD4+CD45RO+.

Les clones de lymphocytes T néoplasiques de patients SS expriment le plus souvent des marqueurs de surface compatibles avec un phénotype de lymphocytes T CD4 à mémoire mature^29,30. Cependant, une plasticité phénotypique a parfois été observée en ce qui concerne les marqueurs de surface, y compris CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 et/ou CD26³¹. Des études antérieures ont également montré l’hétérogénéité de l’expression de CD45RO et CD45RA chez les patients atteints de SS²⁹, alors que la majorité des cas de SS sont encore CD45RO+. Roelens et ^al.31 ont également montré que les SS peuvent présenter une hétérogénéité interindividuelle et intraindividuelle avec une population mixte de sous-ensembles naïfs (TN), de mémoire centrale (TCM), de mémoire transitionnelle (TTM), de mémoire effectrice (TEM) et de mémoire effectrice terminale (TEMRA). Cependant, leurs résultats montrent clairement que la majorité des cellules SS ont un phénotype de MTC. Nous avons concentré notre étude sur l’immunophénotype de surface CD45RO+ le plus courant chez les patients atteints de SS et confirmé le phénotype par cytométrie en flux. Lors de la planification des études de sous-ensembles de cellules T chez les patients, il est important de prendre en compte l’hétérogénéité phénotypique de la maladie étudiée, et la stratégie de purification peut donc être ajustée au besoin pour obtenir la population de cellules T souhaitée pour l’analyse.

Il existe plusieurs façons de stimuler les lymphocytes T et les PBMC pour examiner l’expression fonctionnelle des gènes. Nous préférons l’activation chimique (PMA + A23187 ionophore), car nous nous intéressons à la régulation des gènes dans le noyau. L’activation chimique est une meilleure option à cette fin car elle agit comme un activateur large et est plus uniforme par rapport à la stimulation spécifique de l’antigène. Le PMA est un petit composé organique qui diffuse à travers la membrane cellulaire dans le cytoplasme et active directement la protéine kinase C. A23187 permet au calcium de passer à travers les membranes. Ces composés contournent les récepteurs de surface et, ensemble, imitent les effets de la ligature des récepteurs des lymphocytes T avec une co-stimulation médiée par CD28. Les produits chimiques activent plusieurs voies de signalisation intracellulaires, ce qui entraîne l’activation du facteur de transcription nucléaire et la régulation à la hausse des gènes des cytokines accessibles à l’activation de la transcription. Bien que l’activation chimique et la ligature CD3CD28 produisent des profils d’expression génique globale étonnamment similaires dans les cellules normales³², l’activation chimique avec PMA + A23187 est un bon choix puisque les cellules T SS peuvent perdre l’expression des récepteurs de surface, y compris les composants TCR³³. Chong et ^al.22 ont comparé l’activation des gènes des cytokines entre PMA/A23187 aux anticorps anti-CD3 et anti-CD28 chez les PBMC de patients normaux, précoces MF/CTCL et MF/CTCL tardifs. Ils ont rapporté que PMA / A23187 provoquait une activation plus rapide et plus intense du gène IL-2 par rapport à la stimulation anti-CD3 / CD28. De plus, ils ont montré que la cinétique d’activation plus lente avec les anticorps anti-CD3/CD28 provient potentiellement de la réticulation et de la signalisation membranaire nécessaires à la stimulation. De plus, les tendances dans l’expression des cytokines parmi les différentes populations cellulaires étudiées ont été préservées avec PMA/A23187. Puisque nous nous intéressons à l’activation de l’expression génique, la stimulation chimique est une approche idéale car elle agit comme un activateur large et est plus cohérente par rapport à la stimulation spécifique de l’antigène. La ligature CD3/CD28 est idéale pour étudier les voies importantes dans la transduction du signal membranaire. De plus, l’activation chimique est moins coûteuse et ne nécessite pas d’équipement spécial. Dans la présente étude, PMA + A23187 a significativement activé les gènes des cytokines dans les cellules T ND mais pas SS, suggérant que les cellules T SS présentent des déficiences fonctionnelles en aval du TCR.

En résumé, ce protocole fournit des lymphocytes T phénotypiquement purs à partir de précieux sang dérivé de patients, et une méthode pour évaluer les changements à l’échelle du génome dans l’expression des gènes fonctionnels. Nous démontrons que le profilage transcriptomique des lymphocytes T SS par rapport aux lymphocytes T CD45RO+ normaux révèle de profondes différences dans l’activation des gènes dans les lymphocytes T humains frais des patients atteints de LTC. Ces études aideront à développer des biomarqueurs diagnostiques et des stratégies thérapeutiques ciblant de nouveaux marqueurs dans le LTC. En outre, cette stratégie et ce protocole d’étude des cellules T humaines primaires peuvent être utiles pour s’adapter aux études sur d’autres maladies médiées par les cellules T.

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
10 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170356
1000 ul Pipet tips	VWR	10017-038
15 ml Conical Tubes	Corning	352196
25 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170357
5 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170355
50 ml Conical Tubes	Thermo Scientific	339652
A23187 ionophore	Fisher Scientific	BP595
Centrifuge	Thermo Scientific	75004381
DMSO	Sigma	D2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit	StemCell	19157
FBS	GIBCO	16140-071
HBSS	GIBCO	14185-052
HEPES	Fisher Bioreagents	BP310-500
KHCO3	Fisher Bioreagents	P184-500
Lymphocyte Separation Medium	Corning	25-072-CV
Na2EDTA	ACROS	10378-23-1
NaHCO3	Fisher Bioreagents	S233-500
NH4Cl	Fisher Bioreagents	A661-500
Penicillin-streptomycin solution	GIBCO	15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA)	Sigma	P-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	RAININ	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	RAININ	17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	RAININ	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	RAININ	17014392
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1013
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136
RPMI 1640	GIBCO	31800-022
T-25 Flask	Thermo Scientific	2024-10