Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Summary

Apresentamos um protocolo simples para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico de sangue inteiro obtidos de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sézary, seguido pela seleção de células T CD4+, sua estimulação com phorbol12-myristate13-acetato e ionóforo A23187, e preparação de RNA para perfil transcriômico.

Abstract

Linfomas cutâneos de células T (CTCL) são derivados da transformação e proliferação descontrolada de células T maduras, e os fungoides de micose (MF) e a síndrome de Sézary (SS) representam os subtipos mais comuns. Apesar de uma série de estudos sobre a caracterização da expressão genética, alterações genéticas e anormalidades epigenéticas da TCS, a patogênese molecular de MF/SS permanece incerta. MF refere-se à CTCL mais comum com predominância da pele, e geralmente é limitada à pele, enquanto ss é uma variante leucêmica agressiva de CTCL com envolvimento generalizado da pele e é caracterizada pela distribuição neoplásica principalmente envolvendo sangue, pele e linfonodo. Com foco na prática clínica, a identificação de biomarcadores de expressão genética tem enorme potencial para melhorar o diagnóstico e o tratamento do MF/SS. De fato, estudos transcriômicos recentes identificaram potenciais biomarcadores diagnósticos a partir de diferenças na expressão genética entre células T normais e malignas, o que pode melhorar nossa compreensão da biologia das SS, e revelar potenciais alvos terapêuticos. Este manuscrito descreve um protocolo reprodutível detalhado para o isolamento de células mononucleares de sangue periféricos de sangue fresco de pacientes diagnosticados com SS, seleção de células T de memória CD4+CD45RO+), estimulação química e preparação de RNA adequado para perfil transcriômico para descobrir novos marcadores moleculares prognósticos para obter uma visão adicional sobre a etiologia da doença. A estimulação usando agonista químico para ativar a regulação nuclear fornece uma avaliação mais específica para caminhos importantes na regulação dinâmica da transcrição e expressão genética e elimina defeitos confusos que podem surgir de defeitos de sinalização a montante decorrentes da perda de antígeno TCR na membrana celular. Os dados obtidos a partir da comparação do transcriptome de células SS T não estimuladas para células SS T estimuladas desmascaram defeitos de expressão genética reguladora funcional não evidentes a partir da análise de células quiescentes não estimuladas. Além disso, o método descrito a partir dessa abordagem pode ser adaptado para estudar defeitos de expressão genética de células T em outras doenças imunológicas de células T.

Introduction

Linfoma cutâneo de células T (CTCL), incluindo os subtipos mais comuns mycosis fungoides (MF) e síndrome de Sézary (SS), é um grupo heterogêneo de doenças derivadas da transformação e proliferação descontrolada de células T maduras ^1,2. As células T neoplásicas têm um CD4+CD45RO+maduro, fenotipo^{de memória 3}, e expressam marcadores de adesão à pele, aumentando o epidermotropismo⁴, que se manifesta como uma erupção cutânea particularmente em doenças precoces. O curso clínico de MF é muitas vezes indolente quando sob cuidados gerenciados de rotina, mas um subconjunto de pacientes pode progredir para uma doença mais avançada. Nestes casos de MF, as lesões cutâneas crescem e engrossam em tumores grandes, e as células T neoplásicas podem se disseminar para linfonodos e órgãos viscerais. Em contraste, SS é uma variante mais agressiva e leucêmica da CTCL⁵, caracterizada por uma tríade de sintomas: erithrodermia generalizada (definida como afetando >80% da área total da superfície corporal), linfadonopatia, e presença de mais de 1000/mm³ células T cancerígenas clonais com núcleos de céeblicas, as chamadas células Sézary ^6,7 . O prognóstico para pacientes com SS é significativamente pior do que o MF. A SS é rara com uma taxa de incidência de 0,1/100.000, e representa aproximadamente 3% do total de casos de CCCL ^8,9. A CTCL normalmente se apresenta em idosos com idade mediana de cerca de 60 anos¹⁰ anos. A taxa de incidência da CTCL vinha aumentando e, embora a causa não esteja clara, a taxa se estabilizou desde 1998^11,12.

A patogênese molecular da SS ainda não está clara. Estudos genéticos, epigenéticos e de expressão genética produziram uma riqueza de novos dados, porém permanecem achados inconsistentes, principalmente devido às pequenas coortes de pacientes estudadas², bem como diferenças no design experimental e nas populações^{de controle 13,14}. Uma caracterização genômica e transcriômica melhorada pode lançar luz sobre mecanismos da doença e alvos terapêuticos inexplorados anteriormente. Portanto, mais estudos de uma população maior de pacientes são necessários para entender melhor essa malignidade heterogênea. Os painéis biomarcadores altamente sensíveis e específicos em uma coorte de SS têm tido desempenho menos uniforme em outras coortes¹⁵, o que representa um sério obstáculo no desenvolvimento de biomarcadores diagnósticos e prognósticos confiáveis para ss¹⁶. Os biomarcadores diagnósticos ideais serão consistentemente e altamente expressos em células T malignas, enquanto ausentes ou quase ausentes em células T normais¹⁷. A descoberta de biomarcadores específicos para doenças é importante para o avanço dos protocolos diagnósticos e terapêuticos para a SS.

Dados transcriômicos de alta qualidade para células T malignas e normais requer uma abordagem eficiente e confiável para a preparação da amostra. Aqui, discutiremos uma estratégia detalhada, mas simples, para obter amostras de RNA de populações de células T relevantes para as SS. Discutiremos o isolamento das células mononucleares sanguíneos periféricos (PBMC) do sangue inteiro, seleção magnética negativa de populações de células T CD4+CD45RO+ relevantes para doenças, ativação química para revelar diferenças nas respostas funcionais e preparação do RNA para perfil transcriômico. No protocolo atual, a ativação química tem sido realizada utilizando acetato de mico-contágio phorbol (PMA) e ionóforo de cálcio (A23187)^18,19, pois estudos anteriores mostraram sinalização defeituosa do receptor de células T na CTCL, e a estimulação com PMA/A23187 contorna o receptor de células T^20,21. Além disso, o PMA/A23187 permite uma ativação proximal mais direta dos sinais nucleares necessários para a ativação genética citocina. Finalmente, a estimulação das células T fornece um nível adicional de discernimento sobre a regulação da expressão genética que não poderia ser obtida a partir de células T em repouso onde a mudança dinâmica está ausente.

Protocol

Células humanas são potencialmente infecciosas. Portanto, os experimentos são realizados estritamente de acordo com as precauções e procedimentos necessários discutidos como administração de segurança e saúde ocupacional (OSHA) e equipamentos de proteção individual (EPI). 1. Isolamento de PBMCs de sangue inteiro Colete todos os materiais necessários da Tabela 1 e leve-os à temperatura ambiente (RT). Quente RP10F a 37 °C. Ajuste a centrífuga para RT. Com exceção de centrífugas e contagem de células, execute todas as etapas usando células viáveis em um gabinete de segurança biológica. Obtenha sangue em cinco tubos de 10 mL (quantidade desejada) contendo anticoagulante. Armazene o sangue inteiro à temperatura ambiente (18\u201224 °C). Rotular tubos de separação de 50 mL com o número do sujeito da pesquisa humana para que a amostra de sangue seja processada. Transfira 10\u201215 mL de sangue em cada tubo de separação(s) com o número do sujeito correspondente. Diluir o sangue pelo menos 2 vezes com a solução de sal balanceada de Hank (HBSS). Não exceda 35 mL de sangue diluído por tubo. Cuidadosamente e lentamente suba o sangue com ~13 mL de média de densidade. Observe através do meio de densidade transparente na parte inferior do tubo, e pare de pipetar quando a pipeta estiver quase vazia (para evitar a liberação da bolha). Remova cuidadosamente a pipeta para evitar misturar o sangue e as camadas médias de densidade. Transfira cuidadosamente os tubos de separação preenchidos para a centrífuga sem perturbar as camadas. Centrifugar a 500 x g por 30 min com o freio centrífuga desligado (desaceleração definida para zero).NOTA: Se a centrífuga exibir apenas rpm, consulte as especificações do rotor para estimar o equivalente a rpm para 500 x g. Remova cuidadosamente os tubos de separação da centrífuga sem perturbar as camadas. Observe a camada buffy, que foi formada entre as camadas médias de densidade e plasma. Pipeta de cima para remover e descartar a maior parte da fração de plasma superior, de modo que 10 mL permanece acima do casaco buffy. Coleça com cuidado e lentamente o casaco de buffy. Transfira os casacos buffy de dois tubos de separação para um novo tubo pré-rotulado e estéril de 50 mL, como mostrado na Figura 1. Diluir os PBMCs pelo menos 2 vezes com HBSS, trazendo o volume em cada novo tubo até 50 mL. Lembre-se de trocar o freio da centrífuga para cheio. PbMCs de pelota por centrifugação a 400 x g por 10 min. Remova o supernatante o máximo possível e bata na parte inferior do tubo para soltar a pelota. Para lise, os glóbulos vermelhos residuais (RBC) resuspenquem cada pelota de célula em 1\u20122 mL de tampão de lise de amônio-cloreto-potássio (ACK) por 10 mL de volume sanguíneo original. Incubar por exatamente 5 minutos. Pare prontamente a lise com um volume igual ou maior de HBSS e ajuste o volume para 50 mL. Centrifugar a 400 x g por 10 min. Remova o sobrenatante e toque na parte inferior do tubo para soltar a pelota celular. Células da piscina do mesmo doador. Traga volume de até 50 mL com HBSS. Centrifugar a 400 x g por 10 min. Remova o sobrenatante e toque na parte inferior do tubo para soltar a pelota celular. Resuspend células em 10 mL de meio RP10F quente, e tome uma alíquota para contagem de células viáveis usando azul trypan. Calcule o número total de células em cada amostra usando um hemótmetro. 2. Purificação de células T CD4+CD45RO+ de PBMCs NOTA: A purificação das células T CD4+CD45RO+ dos PBMCs é feita usando separação magnética comercialmente disponível (ver Tabela de materiais) com pequenas modificações. É preferível seguir o manual do kit para o tempo de incubação, pois cada kit comercial tem suas próprias instruções. Lave a quantidade desejada de PBMCs em 10 mL de buffer de seleção. Centrifugar a 400 x g por 10 min. Remova o sobrenatante e bata na parte inferior do tubo para soltar a pelota. Diluir PBMCs para 5 x 107 células/mL no buffer de seleção e transferi-los para um tubo de fundo redondo de poliestireno (12 x 75 mm). Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos por 1 mL de amostra e misture delicadamente. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Imediatamente antes do uso, partículas magnéticas de vórtice por 30 segundos em alta velocidade. Adicione 50 μL de partículas magnéticas por 1 mL de amostra ao tubo contendo PBMCs e misture suavemente. Leve o volume até 2,5 mL com tampão de seleção e misture delicadamente. Coloque o tubo (sem tampa) no ímã e incubar na RT por 2,5 min. Pegue o ímã e, em movimento contínuo, inverta o ímã e o tubo para despejar a suspensão celular enriquecida em um novo tubo estéril. Para aumentar a recuperação, adicione 2,5 mL de tampão de seleção ao tubo restante no ímã, sem perturbar as contas imobilizadas. Mantenha no ímã por mais 2,5 min e repita o passo 2.6 para recuperar células adicionais. Tome uma alíquota para contagem de células viáveis usando azul trypan. Calcule o número total da célula usando um hemocitômetro ou contador celular. Confirme a pureza por citometria de fluxo (Figura 3). 3. Ativação química Ajuste as células T CD4+CD45RO+ para 5 x 106 células/mL com meio RP10F quente e distribua células em pratos de cultura do tamanho desejado. Células de descanso em uma incubadora umidificada de 37 °C 5% DE CO2 durante a noite. Células de pelota descansadas por centrifugação a 400 x g por 10 min. Remova o sobrenatante e toque na parte inferior do tubo para soltar a pelota celular. Ajuste a concentração celular para 5 x 106 células/mL com meio RP10F quente e distribua células 0,5\u20121 x 107 em cada uma das três estéreis tubos de tampa de parafuso.NOTA: Se houver células suficientes disponíveis, estimulações duplicadas ou pontos de tempo adicionais podem ser incluídos no projeto experimental. Estimule as células nos tubos 2 e 3 com PMA e A23187. Adicione PMA a 25 ng/mL e A23187 a 500 ng/mL e misture suavemente. Adicione um volume igual de sulfóxido de dimetil (DMSO) às células do tubo 1 que servirão como veículo (controle). Por exemplo, se usar 1 μL de PMA e 1 μL de A23187, em seguida, adicione 2 μL de DMSO ao tubo do veículo. Mantenha a concentração final de DMSO abaixo de 0,5% em todos os tubos. Solte as tampas dos tubos e retorne as células para a incubadora de 37 °C 5% DE CO2 por 2 h (tubo 2) e 6 h (tubos 1 e 3). No horário indicado, células centrífugas a 500 x g por 10 min. Antes da lise, descarte o máximo possível do sobrenante, sem perturbar a pelota celular. Prontamente, lise as células, conforme orientado por instruções do kit de isolamento RNA comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Proceda com o isolamento do RNA ou congele o lise a -80 °C para processar posteriormente com amostras adicionais.NOTA: A pureza e integridade do RNA podem ser verificadas usando eletroforese microcapillary. Opcional: Para remover completamente todos os traços de DNA da amostra purificada de RNA, use o kit de limpeza de RNA (ver Tabela de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.

Representative Results

Este protocolo inclui procedimentos para o isolamento de PBMCs do sangue SS, purificação de células T CD4+CD45RO+ por seleção negativa, estimulação de células T purificadas e isolamento do RNA total para perfil transcriômico. A Figura 1 descreve o processo de isolamento do PBMC de sangue inteiro. Observe que o rendimento total dos PBMCs de SS variará com o volume sanguíneo inicial e a carga tumoral circulante de cada paciente. Em nosso laboratório, o rendimento médio dos PBMCs SS foi de 4,6 × 106 células/mL de sangue inteiro (1,85 × 106 – 3,25 x 107 células/mL para 7 SS). A viabilidade média de PBMCs isolados foi de 95\u201299%. A Figura 2 mostra alta pureza e viabilidade das células T de memória CD4+CD45RO+ selecionadas. O rendimento médio das células T CD4+CD45RO+ de PBMCs SS foi de 75% (75,6% – 84%), em comparação com 15,9% (3% – 30%) de PBMCs de doadores normais (ND) obtidos a partir de câmaras do Sistema de Leucoreduction (LRS). A viabilidade e pureza das células T CD4+CD45RO+ obtidas por este protocolo de seleção negativa tem sido consistentemente alta (Figura 3). Anteriormente, combinamos o protocolo de ativação acima com microarrays para estudar as mudanças funcionais nos transcritos das células SS e ND T, e demonstramos que as células T de memória SS e os PBMCs de SS expressam mal citocinas e outros genes de resposta imune em comparação com células ND T e PBMCs 19,22,23. A Figura 4 mostra a ativação robusta de vários genes de citocinas, incluindo IL4, IL 10, IL13 e IL22 em células ND T, mas não em células SS T. Este defeito na expressão genética funcional nas células SS T foi confirmado por outros grupos24. Além disso, muitos genes não normalmente expressos em células ND T são altamente expressos em células SS T, tanto em repouso quanto em estimulação seguinte (Figura 4). Estes incluem os genes biomarcadores SS descritos anteriormente DNM3, PLS3, TOX e TWIST1 25,26,27, bem como ANK1 e SGCE, que foram relatados pela primeira vez pelo nosso grupo. Esses biomarcadores positivos são altamente expressos em SS, mas não em ND, e evitam armadilhas técnicas associadas a biomarcadores negativos. Figura 1: isolamento PBMC de sangue inteiro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Seleção negativa de células T de memória CD4+ de PBMCs isolados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: A pureza das células CD4+CD45RO+ T foi confirmada por citometria de fluxo. Os linfócitos foram fechados por dispersão de luz (A), linfócitos vivos excluídos eFluor780 de diluição (B) e (C) representa doadores normais não selecionados (ND). A seleção negativa resultou em populações quase puras de células T CD45RO+ em pacientes com ND (D) e SS (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Expressão genética diferencial em repouso e ativação de células T de memória CD4+CD45RO+ de SS e ND. A expressão genética z-score é representada por uma escala de cores de vermelho (alta expressão) a verde (baixa expressão). As barras coloridas no topo do mapa de calor representam tratamentos celulares: simulação/veículo tratado (vermelho), 2h estimulado (azul) e 6h estimulado (amarelo). Vários genes biomarcadores SS são altamente expressos e os genes de citocina são mal expressos em células SS T em comparação com as células ND T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Reagentes Meio de Densidade Meio de separação linfócito, Ficoll-Hypaque, ou meio de densidade equivalente com densidade = 1,077-1,080g/ml a 20oC. HBSS 1x Solução de sal balanceada da Hank, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.2 RP10F RPMI 1640 médio, 10 % de soro bovino fetal inativado (FBS), 1x solução penicilina-estreptomicina, pH 7.2 Tampão de lise ACK 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Não há necessidade de ajustar pH. Deve ser ~ 7.3. Tampão de seleção 1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA phorbol12-myristate13-acetato (PMA) 50 μg/ml em DMSO A23187 ionóforo 500 μg/ml em DMSO Tabela 1: Reagentes.

Discussion

Várias formas de isolar os PBMCs foram desenvolvidas, e cada uma tem suas próprias vantagens e limitações²⁸. Coletamos rotineiramente até 50 mL de sangue em cinco tubos de 10 mL contendo anticoagulante. O volume do sangue para o isolamento do PBMC depende de diversos fatores, como saúde e idade do sujeito da pesquisa e também da expertise flebotomista. Uma etapa processual crítica no protocolo é a formação do gradiente de passo. A camada ruim pode resultar em falha parcial ou completa dos PBMCs nos sedimentos na interface. Preferimos o método de subcamagem descrito aqui, pois é fácil iniciar a camada inferior. Para dispensar completamente todo o meio de densidade abaixo do sangue, é fundamental usar um auxílio pipeta sem vazamentos de ar. A contaminação da fração PBMC por tipos de células indesejadas pode ser minimizada pela coleta cuidadosa e consistente da camada buffy, que deve ser realizada da mesma forma para cada isolamento. Se os PBMCs não serão ainda mais fracionados, a coleta de diferentes quantidades do gradiente de densidade e camadas plasmáticas entre os isolamentos deve ser evitada. A lise RBC é realizada para minimizar o impacto potencial da contaminação do RNA derivado de RBC e reticulocito nas análises de expressão genética a jusante. A hipotônica será inibida pelo excesso de tampão isotônico.

O isolamento adicional do subconjunto de células T é importante para estudos moleculares. Aqui descrevemos a seleção subsequente de células T CD4+CD45RO+ por seleção negativa para remover tipos de células indesejadas. A seleção negativa baseia-se em anticorpos que reconhecem marcadores de superfície celular específicos para todas as células indesejadas. As células revestidas de anticorpos são então removidas por contas magnéticas. Este protocolo de seleção remove células indesejadas, permitindo que células-alvo intocadas e não estimuladas permaneçam livres flutuantes, o que é essencial para estudar a ativação genética. No entanto, deve-se tomar cuidado para evitar aglomerados celulares, que reduzem a pureza final das células T CD4+ selecionadas. O ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) presente no tampão de seleção minimiza a aglomeração celular. O rendimento das células T depende de fatores como o volume inicial do sangue, variáveis do paciente, como o tratamento que está sendo administrado ao paciente e o estágio da doença no momento da coleta amostral. O tratamento dado aos pacientes também pode afetar a viabilidade celular. Além disso, a coleta de amostras antes de qualquer procedimento, como fotoferese, também tem impacto positivo na pureza das células CD4+CD45RO+ T. Observamos que a coleta de amostras após o procedimento de tratamento da fotoferese tem impacto negativo no rendimento das células T CD4+CD45RO+.

Clones de células T neoplásticas de pacientes com SS expressam mais frequentemente marcadores de superfície consistentes com um fenótipo de células CD4 T maduro^29,30. No entanto, a plasticidade fenotípica tem sido ocasionalmente observada em relação aos marcadores de superfície, incluindo CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 e/ou CD26³¹. Estudos anteriores também mostraram a heterogeneidade na expressão CD45RO e CD45RA entre os pacientes da SS²⁹, enquanto a maioria dos casos de SS ainda são CD45RO+. Roelens et ^al.31 também mostraram que a SS pode exibir heterogeneidade interindividual e intraindividual com população mista de ingenuidade (TN), memória central (TCM), memória transitória (TTM), memória effectora (TEM) e subconjuntos de memória efeito terminal (TEMRA). No entanto, seus resultados mostram claramente que a maioria das células SS tem fenótipo TCM. Focamos nosso estudo no imunofenótipo de superfície CD45RO+ mais comum em pacientes com SS, e confirmamos o fenótipo por citometria de fluxo. No planejamento de estudos de subconjuntos de células T em pacientes, é importante considerar a heterogeneidade fenotípica da doença que está sendo estudada, e a estratégia de purificação pode, portanto, ser ajustada conforme necessário para obter a população celular T desejada para análise.

Existem várias maneiras de estimular células T e PBMCs para examinar a expressão genética funcional. Preferimos ativação química (PMA + A23187 ionophore), pois estamos interessados na regulação genética no núcleo. A ativação química é a melhor opção para este fim, pois atua como um ativador amplo e é mais uniforme em comparação com a estimulação específica de antígeno. O PMA é um pequeno composto orgânico que se difunde através da membrana celular para o citoplasma, e ativa diretamente a proteína quinase C. A23187 permite que o cálcio passe através de membranas. Esses compostos contornam receptores superficiais, e juntos imitam os efeitos da ligação do receptor de células T com co-estimulação mediada por CD28. Os produtos químicos ativam várias vias de sinalização intracelulares, resultando em ativação do fator de transcrição nuclear e regulação de genes citocinas que são acessíveis à ativação da transcrição. Embora a ativação química e a ligadura CD3CD28 produzam perfis de expressão genética global surpreendentemente semelhantes em células normais³², a ativação química com PMA + A23187 é uma boa escolha, uma vez que as células SS T podem perder a expressão de receptores superficiais, incluindo componentes TCR³³. Chong et ^al.22 compararam a ativação de genes citocinas entre os anticorpos PMA/A23187 a anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 em PBMCs de pacientes normais, precoces de MF/CTCL e pacientes com MF/CTCL tardios. Eles relataram que o PMA/A23187 causou uma ativação mais rápida e intensa do gene IL-2 em comparação com a estimulação anti-CD3/CD28. Além disso, eles mostraram que a cinética de ativação mais lenta com anticorpos anti-CD3/CD28 é potencialmente de ligação cruzada e sinalização de membrana necessária para estimulação. Além disso, as tendências de expressão das citocinas entre as diferentes populações celulares estudadas foram preservadas com PMA/A23187. Uma vez que estamos interessados na ativação da expressão genética, a estimulação química é uma abordagem ideal porque age como um ativador amplo e é mais consistente em comparação com a estimulação específica de antígeno. A ligadura CD3/CD28 é ideal para investigar caminhos importantes na transdução de sinal à base de membrana. Além disso, a ativação química é menos cara e não requer equipamentos especiais. No presente estudo, PMA + A23187 ativou significativamente genes de citocina em células ND, mas não SS T, sugerindo que as células SS T têm deficiências funcionais a jusante do TCR.

Em resumo, este protocolo fornece células T fenotipicamente puras a partir de sangue precioso derivado do paciente, e um método para avaliar mudanças em todo o genoma na expressão genética funcional. Demonstramos que o perfil transcriômico das células SS T em comparação com as células T CD45RO+ normais revelam profundas diferenças na ativação genética em células T humanas frescas de pacientes com CTCL. Esses estudos auxiliarão no desenvolvimento de biomarcadores diagnósticos e estratégias terapêuticas voltadas para novos marcadores na CTCL. Além disso, essa estratégia e protocolo no estudo das células T humanas primárias pode ser valioso na adaptação aos estudos de outras doenças mediadas por células T.

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
10 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170356
1000 ul Pipet tips	VWR	10017-038
15 ml Conical Tubes	Corning	352196
25 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170357
5 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170355
50 ml Conical Tubes	Thermo Scientific	339652
A23187 ionophore	Fisher Scientific	BP595
Centrifuge	Thermo Scientific	75004381
DMSO	Sigma	D2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit	StemCell	19157
FBS	GIBCO	16140-071
HBSS	GIBCO	14185-052
HEPES	Fisher Bioreagents	BP310-500
KHCO3	Fisher Bioreagents	P184-500
Lymphocyte Separation Medium	Corning	25-072-CV
Na2EDTA	ACROS	10378-23-1
NaHCO3	Fisher Bioreagents	S233-500
NH4Cl	Fisher Bioreagents	A661-500
Penicillin-streptomycin solution	GIBCO	15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA)	Sigma	P-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	RAININ	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	RAININ	17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	RAININ	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	RAININ	17014392
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1013
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136
RPMI 1640	GIBCO	31800-022
T-25 Flask	Thermo Scientific	2024-10