الحصول على الخلايا العظمية الأولية من خلال تجزئة الفئران الكلالية للخلايا العظمية المعبرة عن GFP
Summary
يصف هذا البروتوكول تشريح كالفاريا الفأر dmp1-topaz الوليدية وعزل الخلايا العظمية التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر من خلال هضم الخلايا وتجزئتها ، بالإضافة إلى تحضير الخلايا العظمية لفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS).
Abstract
إن الخلايا العظمية ، التي كان يعتقد في السابق أنها مقيم سلبي في العظام نظرا لوظيفة وراء الكواليس المتمثلة في استشعار التحميل الميكانيكي ، يتم تسليط الضوء عليها الآن وقد ثبت أن لها وظائف رئيسية متعددة مثل التعديل النشط للمصفوفة خارج الخلية وتشكيل عضو الغدد الصماء مع نظام القناة الجوبية الذي يحيط به إرسال رسائل إلى مواقع بعيدة. نظرا للطرق التي جعلت من الممكن اختبار الخلايا العظمية في المختبر من عزل الخلايا العظمية الأولية إلى خطوط الخلايا الشبيهة بالخلايا العظمية ، تشهد الخلايا العظمية الآن اهتماما مدويا وزيادة في المعرفة حول الهيكل والوظيفة. العديد من جوانب بيولوجيا الخلايا العظمية والتفاعل مع المكونات الجزيئية الأخرى لم يتم اكتشافها بعد. في هذا البروتوكول ، نصف بالتفصيل العزل الفعال للخلايا العظمية الأولية من كالفاريا الفأر الوليدية dmp1-topaz ، والتي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الخلايا العظمية ، من خلال تجزئة الخلايا وبالتالي الحصول على ثقافات الخلايا العظمية الأولية بواسطة FACS.
Introduction
الخلايا العظمية هي خلايا متمايزة نهائيا عن الخلايا السلفية العظمية الأرومية التي أصبحت جزءا لا يتجزأ من المصفوفة المفرزة1. إنها الخلايا الأكثر وفرة والأطول عمرا بين مجموعات الخلايا العظمية. وهي موجودة داخل ثغرات ولها مورفولوجيا نجمية مميزة مع التشعبات التي تمتد عبر قنوات تسمى canaliculi لتشكيل شبكة واسعة من الاتصالات والتبادل الأيضي مع البيئة المحيطة بها وسطح العظام2. تصمم الخلايا العظمية كلا من أدوار بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في إعادة تشكيل العظام ، فهي الخلايا الحسية الميكانيكية الأولية التي تمنح التكيف مع التحميل الميكانيكي3 ، وتشارك في توازن الفوسفات4 وتمعدن مصفوفة العظام5 ، وجنبا إلى جنب مع الجهاز الجوفي ، فإنها تعمل كعضو الغدد الصماء الذي يشير إلى الأنسجة البعيدة6.
تقع الخلايا العظمية داخل مصفوفة معدنية ، مما يحد من إمكانية الوصول ويجعل عزلها صعبا ، وبالتالي يعيق التحقيق في المختبر. وصفت إحدى طرق العزل الأولى الخلايا العظمية المعزولة من كالفاريا الدجاج باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة خاص بالخلايا العظمية (OB7.3)7 والذي عرف لاحقا بأنه البديل الطائر من PHEX (الجين المنظم للفوسفات مع التماثل مع Endopeptidases على كروموسوم X)8. استخدم باحثون آخرون الهضم المتسلسل للفأر 9 أو عظام الفأرالطويلة 10 للحصول على الكسور الغنية بالخلايا العظمية التي تم الإبلاغ عن نقاء الخلايا العظمية فيها حوالي 70٪ 9. تشمل قيود هذا الإجراء النقاء دون المستوى الأمثل للمزارع الملوثة بأنواع الخلايا الأخرى إلى جانب الخلايا العظمية وأن الخلايا العظمية يمكن أن تتضخم بواسطة خلايا أخرى في الثقافة لأن الخلايا العظمية فقدت القدرة على الانقسام. هذه التحديات تحد من قابلية استخدام الثقافات طويلة الأجل.
للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير خطوط خلايا الخلايا العظمية المختلفة. خط الخلية MLO-Y411 وخط الخلية MLO-A512 هي بشكل ملحوظ خطوط الخلايا الأكثر دراسة على نطاق واسع والتي هي مفيدة لدراسة الخلايا العظمية في المرحلة المبكرة. ومع ذلك ، فهي أقل فائدة لدراسة إشارات الخلايا العظمية الناضجة لأنها تعبر عن مستويات منخفضة من sclerostin و FGF2313 ، وكلاهما علامات الخلايا العظمية الناضجة. خطوط الخلايا الأخرى بما في ذلك IDG-SW3 14 و Ocy45415 ، تعبر عن مستويات عالية من sclerostin و FGF23 وهي مفيدة في دراسة مرحلة الخلايا العظمية المتأخرة. تثبت خطوط الخلايا أنها أدوات بحث مفيدة. ومع ذلك ، فهي لا تأتي بدون قيود لأنها لا تمثل بيولوجيا الخلية الأولية بشكل كامل. تمثل خطوط الخلايا المختلفة مراحل نمو مختلفة من طيف نضج الخلايا العظمية ، وتفشل خطوط الخلايا في تمثيل عدم تجانس الخلايا العظمية الأولية16,17.
للحصول على ثقافات نقية للخلايا العظمية الأولية ، استفاد الباحثون من نموذج الماوس cre الذي يستخدم فيه مروج dmp1 8 كيلو بايت لدفع تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في الخلايا العظمية18,19. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا المزدوجة (pOB-Col 2.3- GFP-cyan و DMP1-GFP-topaz) بواسطة Paic et al.19 والفئران المعدلة وراثيا dmp1-topaz بواسطة Nakashhima et al.20 للحصول على مجموعات الخلايا العظمية. حيث استخدموا الهضم المتسلسل و FACS للخلايا العظمية التي تعبر عن GFP للحصول على ثقافات الخلايا العظمية الأولية19,20. تبين أن اتجاه cre في الماوس المراسل dmp1 10-kb Ai9 ، الذي ينشط بروتين tdTomato ، موجود في الخلايا العظمية وبانيات العظم والعضلات والخلايا داخل نخاع العظام. كان لمروج dmp1 8 كيلو بايت نفس نمط التعبير ، ولكن نسبة فقط من بانيات العظم وخلايا نخاع العظم عبرت عن البروتين ، مما يشير إلى أن مروج dmp1 8 كيلو بايت أكثر تحديدا21. على الرغم من ذلك ، يجب تفسير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مروج dmp1 8 كيلو بايت بحذر ، ويجب إجراء ملفات تعريف التعبير الجيني بشكل روتيني باستخدام الخلايا العظمية مقابل العلامات الخاصة ببانيات العظم للتأكد من أن السكان الذين تم الحصول عليهم يتمتعون بدرجة نقاء عالية.
تم العثور على علامات ناقضة العظم OSCAR و Dcstamp في مجموعات الخلايا العظمية غير المستنفدة للدم مقابل الخلايا العظمية المستنفدة ، وقد قادت هذه النتيجة المؤلفين إلى استنتاج أن الهضم الذي تم الحصول عليه من تجزئة 8 كيلو بايت dmp1-topaz alnatal calvaria وفرز GFP ملوثة بخلايا المكونة للدم. كان من الممكن التخفيف من التلوث بالخلايا المكونة للدم عن طريق تشديد بوابة فرز GFP لأن الخلايا المكونة للدم الإيجابية ل GFP كانت لها كثافة GFP أقل بشكل معقول من خلايا اللحمة المتوسطة الإيجابية ل GFP (الخلايا العظمية)22.
ساهمت طرق دراسة الخلايا العظمية في المختبر في الثروة الحديثة من المعلومات حول بيولوجيا الخلايا العظمية. ومع ذلك ، يظل عزل الخلايا العظمية إجراء كثيف العمالة وطويل مع انخفاض إنتاجية الخلايا. الطريقة الموصوفة لهضم العظام باستخدام كولاجيناز و EDTA غالبا ما تصل إلى الكسر 823 ، تستغرق عدة ساعات يتم فيها فرض ضرائب على صلاحية الخلايا العظمية. أفاد الباحثون باستخدام الكسور (2-20125) لفرز الخلايا 20، وأظهروا أن التعبير عن الجينات المرتبطة بالخلايا العظمية مقابل تلك الخاصة ببانيات العظم يؤكد نجاح عزل مجموعات الخلايا العظمية النقية20. في هذه المقالة، نصف عملية الحصول على الكسور (2-5)، ونقارن مردود الخلايا العظمية من كل كسر بدءا من الكسر 1 إلى 8 لتحديد عودة الخلايا العظمية في كل كسر. كما وصفنا تشريح كالفاريا الفأر dmp1-topaz حديثي الولادة والهضم الكالفاري باستخدام كولاجيناز وحمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، بالإضافة إلى تحضير الخلايا ل FACS.
Protocol
Representative Results
Discussion
كانت أول خلية عظمية معزولة من دجاج كالفاريا7 معزولة باستخدام (OB7.3) أو البديل الطيار من PHEX. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة بسبب توافر الأجسام المضادة القابلة للتطبيق ، حيث يجب تصنيع الأجسام المضادة الخاصة بالخلايا العظمية والتي هي أيضا خاصة بالنوع. استخدم الباحثون تعديلا مختل…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة JSPS KAKENHI من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (رقم 19K10397 إلى H.K. ورقم 18K09862 إلى I.M.).
Materials
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
Referencias
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F. Mechanosensation and Transduction in Osteocytes. BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell … and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. . Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
