Ottenere osteociti primari attraverso il frazionamento calvario murino degli osteociti che esprimono GFP

Summary

Questo protocollo descrive la dissezione della calvaria di topo neonatale dmp1-topazio e l’isolamento degli osteociti che esprimono la proteina fluorescente verde attraverso la digestione e il frazionamento cellulare, oltre alla preparazione degli osteociti per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Abstract

L’osteocita, una volta ritenuto un residente passivo dell’osso data la funzione dietro le quinte di rilevare il carico meccanico, è ora portato sotto i riflettori e ha dimostrato di avere molteplici funzioni importanti come modificare attivamente la matrice extracellulare e formare un organo endocrino con il sistema lacunocanalicolare che lo racchiude inviando messaggi a siti distanti. Grazie ai metodi che hanno permesso di testare l’osteocita in vitro dall’isolamento degli osteociti primari alle linee cellulari simili agli osteociti, gli osteociti stanno ora vivendo un interesse clamoroso e un’ondata di conoscenze sulla struttura e la funzione. Molti aspetti della biologia degli osteociti e dell’interazione con altri componenti molecolari devono ancora essere scoperti. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio l’isolamento efficiente degli osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio, che esprimono la proteina fluorescente verde negli osteociti, attraverso il frazionamento cellulare e successivamente l’acquisizione di colture di osteociti primari da parte di FACS.

Introduction

Gli osteociti sono cellule terminalmente differenziate dai progenitori osteoblastici che sono stati incorporati nella loro matrice secreta¹. Sono le cellule più abbondanti e più longeve tra le popolazioni di cellule ossee. Risiedono all’interno di lacune e hanno una caratteristica morfologia stellata con dendriti che si estendono attraverso canali chiamati canalicoli formando una vasta rete di comunicazione e scambio metabolico con l’ambiente circostante e la superficie ossea². Gli osteociti coreografano sia i ruoli degli osteoblasti che degli osteoclasti nel rimodellamento osseo, sono le cellule meccanosensoriali primarie che conferiscono adattamento al carico meccanico³, sono coinvolte nell’omeostasi del fosfato⁴ e nella mineralizzazione della matrice ossea⁵ e, insieme al sistema lacunocanalicolare, agiscono come un organo endocrino che segnala i tessuti distanti⁶.

Gli osteociti sono situati all’interno di una matrice mineralizzata, che limita l’accessibilità e rende difficile il loro isolamento, ostacolando così l’indagine in vitro. Uno dei primi metodi di isolamento ha descritto osteociti isolati dalla calvaria di pollo utilizzando un anticorpo monoclonale osteocita-specifico (OB7.3)⁷ che in seguito è stato conosciuto per essere la variante aviaria di PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)⁸. Altri ricercatori hanno utilizzato la digestione sequenziale delle ossa lunghe del ratto 9 o del topo 10 per ottenere frazioni ricche di osteociti in cui la purezza degli osteociti è stata riportata intorno al⁷⁰%⁹. I limiti di questa procedura includono la purezza sub-ottimale delle colture contaminate con altri tipi di cellule oltre agli osteociti e che gli osteociti potrebbero essere potenzialmente ricoperti da altre cellule in coltura poiché gli osteociti hanno perso la capacità di dividersi. Queste sfide limitano l’usabilità delle culture a lungo termine.

Per superare queste limitazioni, sono state sviluppate diverse linee cellulari di osteociti. La linea cellulare MLO-Y4¹¹ e la linea cellulare MLO-A5¹² sono in particolare le linee cellulari più studiate che sono utili per lo studio degli osteociti allo stadio iniziale; tuttavia, sono meno utili per studiare la segnalazione degli osteociti maturi in quanto esprimono bassi livelli di sclerostina e FGF23¹³, entrambi marcatori di osteociti maturi. Altre linee cellulari, tra cui IDG-SW3 14 e Ocy454¹⁵, esprimono alti livelli di sclerostina e FGF23 e sono utili nello studio dello stadio tardivo degli osteociti. Le linee cellulari si rivelano utili strumenti di ricerca; Tuttavia, non sono privi di limitazioni in quanto non rappresentano pienamente la biologia della cellula primaria. Diverse linee cellulari rappresentano diversi stadi di sviluppo dello spettro di maturità degli osteociti e le linee cellulari non riescono a rappresentare l’eterogeneità degli osteociti primari^16,17.

Per ottenere colture pure di osteociti primari, i ricercatori hanno sfruttato il modello murino cre in cui il promotore dmp1 da 8 kb viene utilizzato per guidare l’espressione della proteina fluorescente verde (GFP) negli osteociti^18,19. Topi transgenici doppi (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topazio) di Paic et ^al.19 e topi transgenici dmp1-topazio di Nakashima et ^al.20 sono stati utilizzati per ottenere popolazioni di osteociti. In cui hanno impiegato la digestione sequenziale e FACS di osteociti che esprimono GFP per acquisire colture di osteociti primari^19,20. La direzione del cre nel topo reporter Ai9 dmp1 da 10 kb, che attiva la proteina tdTomato, ha dimostrato di essere presente negli osteociti, negli osteoblasti, nei muscoli e nelle cellule all’interno del midollo osseo. Il promotore dmp1 da 8 kb aveva lo stesso pattern di espressione, ma solo una percentuale di osteoblasti e cellule del midollo osseo esprimeva la proteina, il che indica che il promotore dmp1 da 8 kb è più specifico²¹. Nonostante ciò, i risultati ottenuti utilizzando il promotore dmp1 da 8 kb devono essere interpretati con cautela e i profili di espressione genica devono essere eseguiti di routine utilizzando marcatori specifici degli osteociti rispetto agli osteoblasti per garantire che la popolazione ottenuta sia di purezza sufficientemente elevata.

I marcatori osteoclasti OSCAR e Dcstamp sono stati trovati in popolazioni di osteociti ematopoietici non impoveriti rispetto a quelli impoveriti, questa scoperta ha portato gli autori a concludere che i digesti ottenuti dal frazionamento della calvaria neonatale dmp1-topazio 8-kb e dalla selezione GFP sono contaminati da cellule ematopoietiche. La contaminazione con cellule ematopoietiche avrebbe potuto essere mitigata stringendo la porta di ordinamento della GFP poiché le cellule ematopoietiche GFP-positive avevano un’intensità GFP ragionevolmente inferiore rispetto alle cellule mesenchimali GFP-positive (osteociti)²².

I metodi per lo studio degli osteociti in vitro hanno contribuito alla recente ricchezza di informazioni sulla biologia degli osteociti. Tuttavia, l’isolamento degli osteociti rimane una procedura laboriosa e lunga con basse rese cellulari. Il metodo descritto di digestione ossea utilizzando collagenasi e EDTA spesso fino alla frazione 8²³, richiede diverse ore in cui la vitalità degli osteociti è tassata. I ricercatori hanno riferito di utilizzare frazioni (2\u20125) per l’ordinamento cellulare 20 e hanno dimostrato che il profilo di espressione dei geni associati agli osteociti rispetto a quelli degli osteoblasti conferma il successo dell’isolamento di popolazioni di osteociti puri²⁰. In questo articolo, descriviamo il processo di ottenimento delle frazioni (2-0125) e confrontiamo la resa degli osteociti da ciascuna frazione a partire dalla frazione da 1 a 8 per determinare il ritorno degli osteociti in ogni frazione. Descriviamo anche la dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonatale e la digestione calvariale usando collagenasi e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), nonché la preparazione delle cellule per FACS.

Protocol

Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite in conformità con le regole e i regolamenti dell’Università di Tohoku. 1. Dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonato Per questo protocollo, utilizzare 6\u20127 cuccioli di C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia topi con inalazione di isoflurano al 5% e quindi trasferire i cuccioli in etanolo al 70%. Trasferire il cucciolo eutanasia in un piatto di coltura non trattato. Usando forbici e …

Representative Results

Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare il processo di ottenimento di colture di osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio attraverso un processo di frazionamento utilizzando collagenasi per degradare la matrice di collagene e EDTA per la chelazione del calcio, dopo di che le cellule vengono preparate per FACS per separare gli osteociti da altre popolazioni cellulari. I metodi per ottenere osteociti primari dalla calvaria di topo neonatale spesso descrivono l’…

Discussion

Il primo osteocita isolato proveniva da una calvaria di pollo⁷ isolata utilizzando (OB7.3) o la variante aviant di PHEX; Tuttavia, questo metodo è limitato dalla disponibilità di anticorpi funzionanti, poiché devono essere prodotti anticorpi specifici per osteociti che sono anche specie-specifici. I ricercatori hanno utilizzato una diversa modifica del processo enzimatico sequenziale per ottenere osteociti da ossa lunghe di topo e ratto; La purezza riportata di queste colture è stata fissata a…

Materials

BD FACSDiva software	BD Biosciences		Data aquisition and analysis
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		5mM EDTA prepared with 0.1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest, Nuaillé, France
Isolation buffer			70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES
Millex Sterile Filter Unit	Merck Millipore, Ireland	SLGV033RS	0.22μm
Nylon cell strainer	FALCON, NY, USA		40μm
Trypsin-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0.5% x10. diluted to x1 in PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin