פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של קלבריה עכברית dmp1-topaz בילוד ובידוד של אוסטיאוציטים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באמצעות עיכול ושבירה של תאים, בנוסף להכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).
האוסטאוציט, שבעבר נחשב לתושב פסיבי של העצם בהתחשב בתפקוד מאחורי הקלעים של חישת עומס מכני, מובא כעת לאור הזרקורים והוכח שיש לו פונקציות עיקריות רבות כמו שינוי פעיל של המטריצה החוץ תאית ויצירת איבר אנדוקריני עם המערכת הלאקונקנאליקולרית התוחמת אותו ושולח הודעות לאתרים מרוחקים. הודות לשיטות שאפשרו לבחון את האוסטיאוציטים במבחנה מבידוד אוסטיאוציטים ראשוניים לשורות תאים דמויי אוסטיאוציטים, אוסטיאוציטים חווים כעת עניין מהדהד ונחשול של ידע על מבנה ותפקוד. היבטים רבים של הביולוגיה של אוסטיאוציטים ואינטראקציה עם רכיבים מולקולריים אחרים עדיין לא התגלו. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את הבידוד היעיל של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz, המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באוסטיאוציטים, באמצעות שבירת תאים ולאחר מכן רכישת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים על ידי FACS.
אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים מאבות אוסטאובלסטיים שהוטמעו במטריצה המופרשת שלהם1. הם התאים הנפוצים ביותר ומאריכי החיים ביותר בקרב אוכלוסיות תאי עצם. הם שוכנים בתוך לאקונה ויש להם מורפולוגיה סטלטלית אופיינית עם דנדריטים המשתרעים דרך ערוצים הנקראים canaliculi ויוצרים רשת נרחבת של תקשורת וחילופי חילוף חומרים עם סביבתם ומשטח העצם2. אוסטיאוציטים כוריאוגרפים הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים תפקידים בעיצוב מחדש של העצם, הם התאים המכנו-סנסוריים העיקריים המעניקים הסתגלות לעומס מכני3, מעורבים בהומאוסטזיס פוספט4 ובמינרליזציה של מטריצת עצם5, ויחד עם המערכת הלאקונקנאליקולרית, הם פועלים כאיבר אנדוקריני המאותת לרקמות מרוחקות6.
אוסטיאוציטים ממוקמים בתוך מטריצה מינרלית, המגבילה את הנגישות והופכת את בידודם למאתגר, ובכך מעכבת חקירה חוץ גופית. אחת משיטות הבידוד הראשונות תיארה אוסטיאוציטים מבודדים מקלבריה עוף באמצעות נוגדן חד-שבטי ספציפי לאוסטאוציטים (OB7.3)7 אשר מאוחר יותר נודע כגרסה העופות של PHEX (גן מווסת PHosphate עם הומולוגיה לאנדופפטידאזות על כרומוזום X)8. חוקרים אחרים השתמשו בעיכול רציף של חולדה 9 או עכבר 10 עצמות ארוכות כדי להשיג שברים עשירים באוסטיאוציטים שבהם דווח על טוהר אוסטיאוציטים בסביבות70%9. מגבלות הליך זה כוללות את הטוהר התת-אופטימלי של תרביות מזוהמות בסוגי תאים אחרים מלבד אוסטיאוציטים, וכי אוסטיאוציטים עלולים להיות מגודלים על ידי תאים אחרים בתרבית מכיוון שאוסטיאוציטים איבדו את היכולת להתחלק. אתגרים אלה מגבילים את השימושיות של תרבויות ארוכות טווח.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו קווי תאים אוסטיאוציטים שונים. קו התאים MLO-Y411 וקו התאים MLO-A512 הם בעיקר קווי התאים הנחקרים ביותר אשר שימושיים לחקר אוסטיאוציטים בשלב מוקדם; עם זאת, הם פחות שימושיים לחקר איתות אוסטיאוציטים בוגר מכיוון שהם מבטאים רמות נמוכות של סקלרוסטין ו- FGF2313, שניהם סמני אוסטיאוציטים בוגרים. קווי תאים אחרים, כולל IDG-SW3 14 ו- Ocy45415, מבטאים רמות גבוהות של סקלרוסטין ו- FGF23 ושימושיים בחקר שלב האוסטיאוציטים המאוחר. קווי תאים מתגלים ככלי מחקר שימושי; עם זאת, הם אינם באים ללא מגבלות מכיוון שהם אינם מייצגים באופן מלא את הביולוגיה של התא הראשוני. קווי תאים שונים מייצגים שלבים התפתחותיים שונים של ספקטרום הבשלות של אוסטיאוציטים, וקווי תאים אינם מייצגים את ההטרוגניות של אוסטיאוציטים ראשוניים16,17.
כדי להשיג תרביות טהורות של אוסטיאוציטים ראשוניים, החוקרים ניצלו את מודל עכבר CRE שבו מקדם dmp1 של 8-kb משמש להנעת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באוסטיאוציטים18,19. עכברים טרנסגניים כפולים (pOB-Col 2.3- GFP-cyan ו- DMP1-GFP-topaz) על ידי Paic et al.19 ועכברים טרנסגניים dmp1-topaz על ידי Nakashima et al.20 שימשו להשגת אוכלוסיות אוסטיאוציטים. שבו הם השתמשו בעיכול רציף ו- FACS של אוסטיאוציטים המבטאים GFP כדי לרכוש תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים 19,20. כיוון ה-cre בעכבר הכתב Ai9 של 10 קילו-בתים dmp1, המפעיל את חלבון tdTomato, הוכח כקיים באוסטיאוציטים, אוסטאובלסטים, שרירים ותאים בתוך מח העצם. למקדם dmp1 של 8 קילובייט הייתה תבנית ביטוי זהה, אך רק חלק מהאוסטאובלסטים ותאי מח העצם ביטאו את החלבון, מה שמצביע על כך שמקדם dmp1 של 8 קילובייט הוא ספציפי יותר21. למרות זאת, יש לפרש בזהירות את התוצאות המתקבלות באמצעות מקדם dmp1 8-kb, ופרופילי ביטוי גנים צריכים להתבצע באופן שגרתי באמצעות סמנים ספציפיים לאוסטאובלסטים לעומת אוסטאובלסטים כדי להבטיח שהאוכלוסייה המתקבלת היא בעלת טוהר גבוה מספיק.
סמני אוסטאוקלסט OSCAR ו- Dcstamp נמצאו באוכלוסיות אוסטיאוציטים לא מדולדלים לעומת אוכלוסיות אוסטיאוציטים מדולדלות, ממצא זה הוביל את המחברים למסקנה כי תקצירים המתקבלים משברים של 8-kb dmp1-topaz קלבריה יילודים ומיון GFP מזוהמים בתאים המטופויטיים. ניתן היה למתן את הזיהום בתאים המטופויטיים על ידי הידוק שער המיון של GFP, מאחר שלתאים המטופויטיים חיוביים ל-GFP הייתה עוצמת GFP נמוכה באופן סביר מאשר לתאים מזנכימליים חיוביים ל-GFP (אוסטיאוציטים)22.
השיטות לחקר אוסטיאוציטים במבחנה תרמו לעושר המידע האחרון על ביולוגיה של אוסטיאוציטים. עם זאת, בידוד אוסטיאוציטים נותר הליך עתיר עבודה וארוך עם תפוקת תאים נמוכה. השיטה המתוארת של עיכול עצם באמצעות collagenase ו EDTA לעתים קרובות עד חלק 823, לוקח כמה שעות שבהן כדאיות אוסטיאוציטים הוא מס. חוקרים דיווחו על שימוש בשברים (2\u20125) למיון תאים 20, והראו כי פרופיל הביטוי של גנים הקשורים לאוסטיאוציטים לעומת אלה של אוסטאובלסטים מאשר את ההצלחה של בידוד אוכלוסיות אוסטיאוציטים טהורים20. במאמר זה נתאר את תהליך קבלת השברים (2\u20125), ונשווה את תפוקת האוסטיאוציטים מכל שבר החל משבריב 1 עד 8 כדי לקבוע את חזרתם של אוסטיאוציטים בכל שבר. אנו מתארים גם את הדיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד ועיכול קלווריאלי באמצעות collagenase וחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), כמו גם הכנת תאים עבור FACS.
האוסטיאוציטים המבודדים הראשונים היו מקלבריה עוף7 שבודד באמצעות (OB7.3) או הגרסה העופית של PHEX; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים מעשיים, כמו נוגדנים ספציפיים אוסטיאוציטים כי הם גם ספציפיים specie צריך להיות מיוצר. החוקרים השתמשו בשינוי שונה של התהליך האנזימטי הרציף כד?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק JSPS KAKENHI מהאגודה היפנית לקידום המדע (מס’ 19K10397 ל- H.K. ומס’ 18K09862 ל- I.M).
BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |