Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D
Summary
Qui, descriviamo un metodo semplice, economico e veloce per risolvere la struttura 3D del tessuto adiposo bianco e topo umano utilizzando una combinazione di marcatori per visualizzare vascolatura, nuclei, cellule immunitarie, neuroni e proteine del mantello di goccia lipidi mediante imaging fluorescente.
Abstract
L’obesità è un importante problema di salute pubblica a livello mondiale che aumenta il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2 e malattie del fegato. L’obesità è caratterizzata da un aumento della massa del tessuto adiposo (AT) a causa dell’iperplasia adipocita e/o dell’ipertrofia, che porta a una profonda ristrutturazione della sua struttura tridimensionale. Infatti, la massima capacità di AT di espandersi durante l’obesità è fondamentale per lo sviluppo di patologie associate all’obesità. Questa espansione AT è un importante meccanismo omeostatico per consentire l’adattamento a un eccesso di assunzione di energia e per evitare la fuoriuscita di lipidi deleteri ad altri organi metabolici, come il muscolo e il fegato. Pertanto, comprendere il rimodellamento strutturale che porta al fallimento dell’espansione AT è una questione fondamentale con un’elevata applicabilità clinica. In questo articolo, descriviamo un metodo di compensazione semplice e veloce che viene regolarmente utilizzato nel nostro laboratorio per esplorare la morfologia del topo e del tessuto adiposo bianco umano mediante imaging fluorescente. Questo metodo di compensazione AT ottimizzato è facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio standard dotato di una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio fluorescente. Inoltre, i composti chimici utilizzati sono prontamente disponibili. È importante sottolineare che questo metodo consente di risolvere la struttura 3D AT colorando vari marcatori per visualizzare specificamente gli adidociti, le reti neuronali e vascolari e la distribuzione innata e adattiva delle cellule immunitarie.
Introduction
L’obesità è caratterizzata da un aumento della massa dei tessuti adiposa ed è diventata un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo, dato che le persone con obesità hanno aumentato il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2, malattie epatiche e alcuni tumori.
Una funzione fisiologica fondamentale del tessuto adiposo è quella di modulare il glucosio di tutto il corpo e l’omeostasilipido 1,2. Durante il periodo di alimentazione, gli adipociti (cioè le cellule principali del tessuto adiposo) immagazzinano l’eccesso di glucosio e lipidi forniti da un pasto in trigliceridi. Durante il digiuno, gli adipociti scomporsino i trigliceridi in acidi grassi non esterificati e glicerolo per sostenere la domanda di energia del corpo. Durante lo sviluppo dell’obesità, il tessuto adiposo si espande aumentando le dimensioni (ipertrofia) e/o il numero (iperplasia) degli adipociti1, per aumentare la loro capacità di stoccaggio. Quando l’espansione del tessuto adiposo raggiunge il suo limite, una costante altamente variabile tra i pazienti, i lipidi rimanenti si accumulano in altri organi metabolici tra cui muscoli efegato 3,4, portando al loro fallimento funzionale e avviando complicazioni cardio-metaboliche legate all’obesità1,5. Pertanto, identificare i meccanismi che regolano l’espansione del tessuto adiposo è una sfida clinica chiave.
Le modifiche morfologiche documentate all’interno dei tessuti adiposo durante l’obesità sono legate alla sua disfunzione patologica. Diverse procedure di colorazione sono state utilizzate per descrivere l’organizzazione dei tessuti del tessuto adiposo, tra cui actin6, marcatori vascolari7, marcatori lipidico-droplet8e specifici marcatori di cellule immunitarie9,10. Tuttavia, a causa dell’enorme diametro degli adipociti (da 50 a 200 m)11, è essenziale analizzare gran parte dell’intero tessuto in tre dimensioni al fine di analizzare con precisione i drammatici cambiamenti strutturali di AT osservati durante l’obesità. Tuttavia, poiché la luce non penetra in un tessuto opaco, l’imaging in 3D all’interno di un grande campione di tessuto utilizzando la microscopia a fluorescenza non è possibile. I metodi di compensazione dei tessuti per renderli trasparenti sono stati riportati nella letteratura (per una revisione,vedi 12) che consente di eliminare i tessuti e di eseguire una microscopia a fluorescenza dell’intero tessuto in profondità. Questi metodi offrono opportunità senza precedenti per valutare l’organizzazione cellulare 3D in tessuti sani e mationali. Ciascuno dei metodi descritti presenta vantaggi e svantaggi e pertanto deve essere selezionato attentamente a seconda del tessuto studiato (per una revisione, vedere13). Infatti, alcuni approcci richiedono un lungo periodo di incubazione e/o l’uso di materiali o composti che sono costosi, tossici o difficili daottenere 14,15,16,17,18,19. Approfittando di uno dei primi composti utilizzati un secolo fa da Werner Spalteholz per ripulire i tessuti20, abbiamo istituito un protocollo user-friendly ed economico che è molto ben adattato per la pulizia di tutti i depositi di topi e tessuti adiposo umani in qualsiasi laboratorio con attrezzature tipiche tra cui una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modifiche che si verificano all’interno del tessuto adiposo nel corso della progressione patologica, come quella dell’obesità, sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi alla base della patologia. Studi pionieristici che hanno rivelato tali meccanismi nel tessuto adiposo sono stati basati su approcci globali come la proteomica del tessuto adiposointero 21, la citometria di flusso22,23e la trascrittomica24</s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da INSERM, Università della Costa Azzurra, e con sovvenzioni dell’Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso gli investimenti per il futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), il programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) tramite Academy 2 “Systèmes Complexes” e Academy 4 “Complexité et diversité du vivant”, Fondation pour la Recherche Médical (‘quipe FRM DEQ201839587), e il Programma Giovani Investigatori a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-(ANSA) – EREARON. Ringraziamo anche l’Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, e che è supportato anche dalla piattaforma IBISA Microscopy and Imaging C’tzur (MICA). Ringraziamo Marion Dussot per l’aiuto tecnico nella preparazione dei tessuti. Ringraziamo Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, per la lettura a prova del manoscritto.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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