Изучение структуры жировой ткани путем очистки метилсалицилата и 3D-изображения
Summary
Здесь мы описываем простой, недорогой и быстрый метод очистки для решения 3D-структуры как мыши, так и человеческой белой жировой ткани, используя комбинацию маркеров для визуализации сосудов, ядер, иммунных клеток, нейронов и белков липидно-капельного слоя с помощью флуоресцентных изображений.
Abstract
Ожирение является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, что повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа 2 и заболеваний печени. Ожирение характеризуется увеличением жировой ткани (AT) массы из-за гиперплазии адипоцитов и/ или гипертрофии, что приводит к глубокой реконструкции его трехмерной структуры. Действительно, максимальная способность AT расширяться во время ожирения имеет решающее значение для развития связанных с ожирением патологий. Это расширение AT является важным гомеостативным механизмом, позволяющим адаптироваться к избытку потребления энергии и избежать пагубного распространения липидов на другие метаболические органы, такие как мышцы и печень. Таким образом, понимание структурной реконструкции, которая приводит к провалу расширения AT является фундаментальным вопросом с высокой клинической применимостью. В этой статье мы описываем простой и быстрый метод очистки, который обычно используется в нашей лаборатории для изучения морфологии мыши и человеческой белой жировой ткани с помощью флуоресцентных изображений. Этот оптимизированный метод очистки AT легко выполняется в любой стандартной лаборатории, оснащенной химическим капюшоном, контролируемым температурой орбитальным шейкером и флуоресцентным микроскопом. Кроме того, используемые химические соединения легко доступны. Важно отметить, что этот метод позволяет решить 3D AT структуры путем окрашивания различных маркеров специально визуализировать адипоцитов, нейронных и сосудистых сетей, а также врожденные и адаптивные распределения иммунных клеток.
Introduction
Ожирение характеризуется увеличением жировой массы тканей и стало одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, учитывая, что люди с ожирением имеют повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа-2, заболеваний печени и некоторых видов рака.
Фундаментальная физиологическая функция жировой ткани заключается в модулировать глюкозу всего тела и липидный гомеостаз1,,2. В период кормления адипоциты (т.е. основные клетки жировой ткани) хранят избыток глюкозы и липидов, предоставляемых при приеме пищи в триглицериды. Во время поста адипоциты распадают триглицериды на неестерифицированные жирные кислоты и глицерол для поддержания спроса на энергию в организме. Во время развития ожирения жировая ткань расширяется за счет увеличения размера (гипертрофии) и/или количества (гиперплазии) адипоцитов1,чтобы увеличить их емкость. Когда расширение жировой ткани достигает своего предела, постоянная высокая переменная среди пациентов, остальные липиды накапливается в других метаболическихорганов,включаямышцы и печень 3,4, что приводит к их функциональной недостаточности и инициирования связанных с ожирениемкардио-метаболических осложнений 1,5. Таким образом, определение механизмов, которые регулируют расширение жировой ткани является ключевой клинической проблемой.
Морфологические изменения, задокументированные в жировых тканях при ожирении, связаны с его патологической дисфункцией. Несколько процедур окрашивания были использованы для описания организации тканей жировой ткани, в том числеактин 6, сосудистыемаркеры 7, липидно-капельныемаркеры 8, и конкретные маркерыиммунных клеток 9,10. Однако, из-за огромного диаметра адипоцитов (от 50 до 200мкм) 11, важно проанализировать большую часть всей ткани в трех измерениях, с тем чтобы точно проанализировать драматические структурные изменения AT наблюдается во время ожирения. Однако, поскольку свет не проникает в непрозрачные ткани, визуализация в 3D в больших образцах тканей с использованием флуоресцентной микроскопии невозможна. Методы очистки тканей, чтобы сделать их прозрачными были зарегистрированы в литературе (для обзора,см. 12), что позволяет очистить ткани и выполнять углубленную, всю ткань флуоресценции микроскопии. Эти методы предлагают беспрецедентные возможности для оценки 3D клеточной организации в здоровых и больных тканях. Каждый из описанных методов имеет преимущества и недостатки, и поэтому должны быть тщательно отобраны в зависимости от изученной ткани (для обзора,см. 13). Действительно, некоторые подходы требуют длительного инкубационный период и / или использование материалов или соединений, которые являются либо дорогими, токсичнымиили трудно получить 14,,15,,16,,17,18,19. Воспользовавшись одним из первых соединений, используемых сто лет назад Вернер Spalteholzдля очистки тканей 20, мы создали удобный и недорогой протокол, который очень хорошо приспособлен для очистки всех мыши и человека жировой ткани складов в любой лаборатории с типичным оборудованием, включая химический капюшон, температура контролируемых орбитальный шейкер и конфокальный микроскоп.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изменения, которые происходят в жировой ткани в течение патологического прогрессирования, таких как ожирение, имеет основополагающее значение для понимания механизмов, стоящих за патологией. Новаторские исследования, которые показали такие механизмы в жировой ткани были основаны на …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана INSERM, Лазурным университетом, и гранты От Французского национального исследовательского агентства (ANR) через Инвестиции в будущее Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), программа UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) через Академию 2 “Комплексы Системеса” и Академия 4 “Комплекс и диверсификация дю Вивант”, Фонд за Recherche M’dical (Кипе FRM DE-20180839587), и Программа молодых следователей j.G. (ANR18-CE14-0035-01-01-ГИЛЛЕРОН). Мы также благодарим Основной фонд визуализации C3M, финансируемый Департаментом По делам Альп-морей и РКА, который также поддерживается Микроскопией IBISA и Платформой изображений Лазурный берег (MICA). Мы благодарим Марион Дусзо за техническую помощь в подготовке тканей. Мы благодарим Эбби Каттрис, Международную научную видимость UCA, за доказательство прочтения рукописи.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Referencias
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
