פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להכין דגימות קריסטלוגרפיה סדרתיות לאיסוף נתונים על מזרק צמיג גבוה, Lipidico, שהוזמן לאחרונה בסנכרון האוסטרלי.
Abstract
מתקן לביצוע מדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות פותח בסנכרון האוסטרלי. מתקן זה משלב מזרק צמיג גבוה שנבנה למטרה, Lipidico, כחלק מקו הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית (MX2) למדידת מספר גדול של גבישים קטנים בטמפרטורת החדר. מטרת טכניקה זו היא לאפשר גידול/העברה של גבישים למזרקי זכוכית ישירות במזרק לאיסוף נתונים קריסטלוגרפיה סדרתית. היתרונות של מזרק זה כוללים את היכולת להגיב במהירות לשינויים בקצב הזרימה ללא הפרעה של הזרם. קיימות מספר מגבלות עבור מזרק צמיגות גבוה זה (HVI) הכוללות הגבלה על צמיגות הדגימה המותרת ל- >10 Pa.s. יציבות זרם יכולה גם להיות בעיה בהתאם למאפיינים הספציפיים של המדגם. פרוטוקול מפורט כיצד להגדיר דגימות ולהפעיל את המזרק למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי מוצג כאן. השיטה מדגימה הכנת המדגם, כולל העברת גבישי lysozyme לתוך מדיה צמיגה גבוהה (גריז סיליקון), ואת הפעולה של המזרק לאיסוף נתונים ב MX2.
Introduction
קריסטלוגרפיה סדרתית (SX) היא טכניקה שפותחה בתחילה בהקשר של לייזרים אלקטרונים ללא קרני רנטגן (XFELs)1,2,3,4. למרות גישות היעד קבוע יכול לשמש SX5,6,7, בדרך כלל, מערכות מזרק משמשים כדי לספק גבישים בזרם רציף לקרן הרנטגן. מכיוון שהוא משלב נתונים ממספר רב של גבישים, SX נמנע מהצורך ביישור גביש במהלך הניסוי, ומאפשר איסוף נתונים בטמפרטורת החדר8,9. בעזרת מזרק מתאים, הגבישים מוזרמים בזה אחר זה לאזור האינטראקציה של קרני הרנטגן ונתוני עקיפה וכתוצאה מכך נאספים על גלאי אזור9,10. עד כה, SX הצליחה לפתור מספר מבני חלבון1,11,12,13 כולל גבישים קטנים מכדי למדוד באמצעות קריסטלוגרפיה קונבנציונלית. היא גם סיפקה תובנות חדשות על הדינמיקה המולקולרית שנפתרה בזמן על ידי ניצול משך הדופק femtosecond של XFEL. על ידי ייזום תגובות משאבה בדיקה עם מקורות לייזר אופטיים, מחקרים מעמיקים בוצעו על פוטוסיסטם II14,15, חלבון צהוב פוטואקטיבי16,17, ציטוכרום C אוקסידאז18, כמו גם בקטריאורהודופסין19,20,21. מחקרים אלה בדקו את הדינמיקה של העברת אלקטרונים המתרחשת בעקבות הפעלת אור המדגימה את הפוטנציאל המשמעותי של קריסטלוגרפיה סדרתית להבנת תהליכים ביולוגיים שנפתרו בזמן.
פיתוח של קריסטלוגרפיה סדרתית הוא גם הופך נפוץ יותר ויותר במקורות synchrotron9,12,20,22,23,24. SX מבוסס Synchrotron מאפשר למספר גדול של גבישים בודדים להימדד ביעילות בטמפרטורת החדר באמצעות מערכת מזרק מתאימה. גישה זו מתאימה גבישים קטנים יותר ומכאן, בנוסף לדרוש גלאי קצב מסגרות מהיר כדי לאסוף את הנתונים, קרן מיקרו ממוקדת נדרשת גם. בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית, SX אינו כרוך בהרכבה ויישור של גבישים בודדים בקרן הרנטגן. מכיוון שנתונים ממספר רב של גבישים בודדים ממוזגים, ניתן להפחית באופן משמעותי את מינון הקרינה המתקבל על ידי כל גביש בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית. ניתן להחיל את Synchrotron SX גם על חקר התגובות שנפתרו בזמן, אפילו עד למשטר אלפיות השניה, בתנאי שגלאי עם קצב מסגרות גבוה מספיק זמין (למשל, 100 הרץ או יותר). מספר ניסויים קריסטלוגרפיים סדרתיים בוצעו בסנכרון באמצעות מזרקים שפותחו בתחילה במקורות XFEL20,22,23. שני הסוגים הנפוצים ביותר של מזרק הם זרבובית וירטואלית דינמי גז (GDVN)25 מזרק צמיג גבוה (HVI)9,24,26,27,28. GDVN הוא אידיאלי להזרקת צמיגות נמוכה, דגימות נוזליות, אבל דורש שיעורי זרימה גבוהים כדי להשיג זרמים יציבים, אשר בתורו מוביל לשיעורי צריכת מדגם גבוהים. לעומת זאת, HVI’s מתאימים לדגימות צמיגות גבוהות המאפשרות יצירת זרם יציב בקצב זרימה נמוך בהרבה, מה שמוביל לצריכת מדגם נמוכה בהרבה. מזרק HVI, אם כן, מעדיף משלוח של דגימות שבו נשא צמיג עדיף (למשל, שומנים מבוססי חלבונים קרום) ו / או כמויות גדולות של מדגם אינם זמינים. מזרקי SX הם בדרך כלל מאתגרים לשימוש ודורשים הכשרה נרחבת כדי לפעול. הם כוללים גם פרוטוקולי העברה מדגם ארוכים, כמו המדגם צריך להיות טעון לתוך מאגר מיוחד, זה בדרך כלל יש סיכון גבוה הקשורים אליו של מדגם הולך לאיבוד או “נפח מת” או באמצעות דליפות בחיבורים. לכן, רצוי לייעל את עיצוב המזרק כדי למתן את כל ההפסדים לפני המדגם להגיע קרן רנטגן.
לאחרונה, תוצאות SX הראשון פורסמו באמצעות Lipidico23 עם יעד lysozyme, באמצעות גלאי Eiger 16M. עיצוב מזרק זה מגביל את בזבוז הדגימה על ידי מזעור מספר השלבים המעורבים במעבר מהתגבשות ראשונית להעברת גבישים למזרק ואחריו מסירת דגימה לקרן הרנטגן. כתב יד זה מתאר ומדגים את הליך ההעברה לדוגמה החל מהכנת מדגם, מעבר לתהליך ההזרקה, ולבסוף איסוף נתונים, באמצעות אותו כלי התגבשות. הפעולה של המזרק מתוארת גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
HVI חלופי פותח, אידיאלי לביצוע ניסויי SX במקורות synchrotron. יש לו שני יתרונות מרכזיים על פני HVIs קיימים. ראשית, קל להתקין על קו הקרן המאפשר מעבר מהיר בין קריסטלוגרפיה קונבנציונלית SX, רק ~ 30 דקות נדרש להתקנה ויישור על MX2. שנית, מזרקי המדגם המשמשים לגידול גבישים יכולים לשמש ישירות כמאגרים להזרקה, הגבל?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המצוינות של מועצת המחקר האוסטרלית בהדמיה מולקולרית מתקדמת (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). מחקר זה נערך בחלקו באמצעות קרן MX2 ב Synchrotron האוסטרלי, חלק ANSTO, ועשה שימוש בגלאי הקרן האוסטרלית לחקר הסרטן (ACRF).
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
Referencias
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok’s photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the “Lipidico” injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
