Протокол инъекций Липидико для серийных измерений кристаллографии в австралийском синхротроне
Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как подготовить серийные образцы кристаллографии для сбора данных на высоком вязком инжекторе, Lipidico, недавно введенном в эксплуатацию в австралийском синхротроне.
Abstract
На австралийском синхротроне разработана система для проведения серийных измерений кристаллографии. Этот объект включает в себя специально построенный высоковязкий инжектор, Lipidico, как часть макромолекулярной кристаллографии (MX2) луч для измерения большого количества мелких кристаллов при комнатной температуре. Цель этого метода заключается в том, чтобы позволить кристаллы, которые будут выращиваться / передаваться в стеклянные шприцы, которые будут использоваться непосредственно в инжектор для последовательного сбора данных кристаллографии. Преимущества этого инжектора включают способность быстро реагировать на изменения скорости потока без прерывания потока. Существует ряд ограничений для этого высоковязкого инжектора (HVI), которые включают в себя ограничение на разрешенную вязкость образца до 10 па.с. Стабильность потока также потенциально может быть проблемой в зависимости от конкретных свойств образца. Здесь представлен подробный протокол о том, как настроить образцы и эксплуатировать инжектор для серийных измерений кристаллографии на австралийском синхротроне. Метод демонстрирует подготовку образца, в том числе передачу кристаллов лизозима в высоковязкие средства массовой информации (силиконовая смазка), а также работу инжектора для сбора данных на MX2.
Introduction
Серийная кристаллография (SX) является метод, который был разработан первоначально в контексте рентгеновских свободных электронных лазеров (XFELs)1,2,3,4. Хотя фиксированные целевые подходы могут быть использованы для SX5,6,7, как правило, инъекционные системы используются для доставки кристаллов в непрерывном потоке к рентгеновскому лучу. Поскольку он сочетает в себе данные из большого количества кристаллов, SX избегает необходимости любого выравнивания кристалла во время эксперимента, и позволяет собирать данные прикомнатной температуре 8,9. С помощью подходящего инжектора кристаллы потекли один за другим в область рентгеновского взаимодействия, и полученные данные дифракции собираются на детектореобласти 9,10. На сегодняшний день, SX был успешным в решении рядабелковых структур 1,11, 12,13в томчислекристаллы слишком малы, чтобы измерить с помощью обычной кристаллографии. Он также предоставил новые идеи в время решена молекулярной динамики, используя фемтосекундный пульс продолжительность XFEL. Путем инициирования насос-зонд реакции с оптическими лазерными источниками, углубленные исследования были проведены нафотосистеме II 14,15, фотоактивный желтый белок16,17, цитохром Cоксидазы 18, а также бактериофодопсин19,20,21. Эти исследования исследовали динамику передачи электронов, которые происходят после активации света, демонстрируя значительный потенциал серийной кристаллографии для понимания времени решенных биологических процессов.
Развитие серийной кристаллографии также становится все более распространенным присинхротронных источниках 9,12,20,22,23,24. Синхротрон на основе SX позволяет эффективно измерять большое количество отдельных кристаллов при комнатной температуре с помощью соответствующей инжекторной системы. Этот подход подходит для небольших кристаллов, следовательно, в дополнение к необходимости быстрого детектора частоты кадров для сбора данных, микро-ориентированный луч также требуется. По сравнению с обычной кристаллографией, SX не предполагает монтажа и выравнивания отдельных кристаллов в рентгеновском луче. Поскольку данные из большого количества отдельных кристаллов сливаются, доза радиации, полученная каждым кристаллом, может быть существенно снижена по сравнению с обычной кристаллографией. Синхротрон SX также может быть применен к изучению реакций, решенных по времени, вплоть до миллисекундного режима, при условии наличия детектора с достаточно высокой частотой кадров (например, 100 Гц и более). Несколько серийных экспериментов кристаллографии были проведены на синхротроне с использованием инжекторов, которые были первоначально разработаны в источниках XFEL20,22,23. Двумя наиболее распространенными типами инжекторов являются Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 и High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. GDVN идеально подходит для введения низкой вязкости, жидких образцов, но требует высоких скоростей потока для достижения стабильных потоков, что, в свою очередь, приводит к высоким показателям потребления выборки. В отличие от этого, HVI подходят для образцов высокой вязкости, что позволяет создавать стабильный поток при гораздо более низких скоростях потока, что приводит к гораздо более низкому потреблению выборки. Таким образом, инжектор HVI выступает за доставку образцов, в которых предпочтительнее вязкий носитель (например, липидная основе мембранных белков) и/или большое количество образцов. SX инжекторы, как правило, сложны в использовании и требуют обширной подготовки для работы. Они также включают в себя длительные протоколы передачи образцов, так как образец должен быть загружен в специализированный резервуар, это, как правило, имеет высокий риск, связанный с его образца теряется либо в “мертвый объем” или через утечки в соединениях. Поэтому желательно оптимизировать конструкцию инжектора, чтобы смягчить любые потери до того, как образец достиг рентгеновского луча.
Недавно были опубликованы первые результаты SX с использованием Lipidico23 с лизозимной мишенью с помощью детектора Eiger 16M. Эта конструкция инжектора ограничивает потери образца, минимизируя количество шагов, участвующих в переходе от первоначальной кристаллизации к передаче кристаллов в инжектор с последующим доставкой образца в рентгеновский луч. Эта рукопись описывает и демонстрирует процедуру передачи образца, начиная с подготовки образца, переходя к процессу инъекций и, наконец, сбора данных, используя тот же сосуд кристаллизации. Описана также работа инжектора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработан альтернативный HVI, идеально подходит для проведения экспериментов SX на синхротронных источниках. Он имеет два ключевых преимущества по сравнению с существующими HVIs. Во-первых, легко установить на балку, позволяющую быстро переключаться между обычной кристаллографией и SX, д?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом Центр передового опыта в области передовой молекулярной визуализации (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Это исследование было проведено частично с использованием луча MX2 в Австралийском синхротроне, входя в состав ANSTO, и использовало детектор Австралийского фонда исследований рака (ACRF).
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
Referencias
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok’s photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the “Lipidico” injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
