Un ex Vivo Choroid Sprouting Assay de l’angiogenèse microvasculaire oculaire
Summary
Ce protocole présente l’essai choroïde de germination, un modèle ex vivo de prolifération microvasculaire. Cet essai peut être utilisé pour évaluer les voies impliquées dans la prolifération des micro-vaisseaux choroïdiens et évaluer les traitements médicamenteux à l’aide de tissus de souris sauvages et génétiquement modifiés.
Abstract
L’angiogenèse choroïde pathologique, une caractéristique saillante de la dégénérescence maculaire relative à l’âge, mène à l’affaiblissement de vision et à la cécité. Les tests de prolifération des cellules endothéliales (EC) utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs) ou des EC rétiniennes primaires isolées sont largement utilisés dans des modèles in vitro pour étudier l’angiogenèse rétinienne. Cependant, isoler les cellules endothéliales rétiniennes murines pures est techniquement difficile et les CE rétiniens peuvent avoir des réponses de prolifération différentes que les cellules endothéliales choroïdes et les différentes interactions cellule/cellule. Un essai choroïdien choroïde fortement reproductible de germination comme modèle de prolifération microvasculaire choroïde a été développé. Ce modèle inclut l’interaction entre la vascularisation choroïde (EC, macrophages, péricytes) et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Les explants rpe/choroïdes/scléraux de souris sont isolés et incubés dans l’extrait basal de membrane croissance-facteur-réduit (BME) (jour 0). Le milieu est changé tous les deux jours et la germination choroïde est quantifiée au jour 6. Les images de l’explantation choroïde individuelle sont prises avec un microscope de phase inversée et la zone de germination est quantifiée à l’aide d’un plug-in macro semi-automatisé au logiciel ImageJ développé dans ce laboratoire. Cet essai reproductible de germination choroïde ex vivo peut être employé pour évaluer des composés pour le traitement potentiel et pour la recherche microvasculaire de maladie pour évaluer des voies impliquées dans la prolifération choroïde de micro navire utilisant le type sauvage et le tissu génétiquement modifié de souris.
Introduction
La dysrégulation choroïde d’angiogenèse est associée à la dégénérescence maculaire relative à l’âge néoovasculaire (DME)1. Le choroïde est un lit microvasculaire présent sous l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Il a été démontré que la réduction du flux sanguin dans le choroïde est associée à la progression de la D AMD2. La relation complexe entre l’endothélium vasculaire, l’EPR, les macrophages, les péricytes et d’autres cellules est responsable de l’homéostasiedu tissu 3,4,5. Par conséquent, un microenvironnement choroïdien reproductible de modélisation d’essai est critique pour l’étude de la DMO néovasculaire.
Les analyses d’angiogenèse ex vivo et les cultures cellulaires endothéliales in vitro peuvent compléter les études sur le comportement microvasculaire in vivo, pour tester de nouveaux médicaments et pour des études sur la pathogénie. Les cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs), les cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC), le cerveau animal primaire isolé ou les CE rétiniens sont souvent utilisées dans des études in vitro pour la recherche sur l’angiogenèseoculaire 6,7,8. Les HRMEC en particulier ont été largement utilisés comme modèle de néovascularisation choroïdienne in vitro (CNV)9 en évaluant la prolifération endothéliale, la migration, la formation tubulaire et les fuites vasculaires pour évaluer les interventions6,10. Cependant, les CE en culture sont limités comme modèle de CNV en raison du manque d’interactions avec d’autres types de cellules trouvés dans le choroïde et parce que la plupart des EC utilisés dans ces analyses ne proviennent pas de choroïdes. Les CE choroïdes de souris sont difficiles à isoler et à maintenir dans la culture.
L’essai aortique d’anneau est employé couramment comme modèle de prolifération vasculaire macro. Les pousses vasculaires provenant d’explants aortiques comprennent les CE, les péricytes et les macrophages11. L’essai d’anneau aortique modèle le grand angiogenèse denavire bien 12,13,14. Cependant, il a des limitations comme modèle de néovascularisation choroïdienne car les anneaux aortiques sont un tissu macrovasculaire dépourvu de l’environnement microvasculaire choroïde caractéristique, et les germes des grands vaisseaux peuvent différer des germes des réseaux capillaires impliqués dans la pathologie microvasculaire. Récemment, un groupe a publié un essai rétinien ex vivo15,16. Bien qu’il soit approprié pour la maladie néovasculaire rétinienne, il n’est pas aussi approprié pour la néovascularisation choroïde comme vu dans AMD.
L’essai choroïde de germination utilisant le RPE de souris, le choroïde, et le tissu explanté sclérical a été développé pour mieux modéliser CNV. Le tissu peut facilement être isolé des yeux de souris (ou d’autres espèces)17. Cet essai permet l’évaluation reproductible du potentiel pro- et anti-angiogenic des composés pharmacologiques et l’évaluation du rôle des voies spécifiques dans la néovascularisation choroïde utilisant le tissu des souris génétiquement modifiées et contrôle18. Cet essai choroïde de germination a été référencé dans beaucoup de publicationssuivantes 9,10,18,19,20. Ici, la méthode impliquée dans l’utilisation de cet essai sont démontrées.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse choroïdienne de germination aide la recherche dans amd néovasculaire9,10,18,19,20. Les explantations choroïdes peuvent être isolées de souris ainsi que de rats etd’humains 17,21. L’explant choroïde comprend les CE, les macrophages et les péricytes17. Dans …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), du Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, de la Boston Children’s Hospital Ophthalmology Foundation, du BCH Pilot Award, de la BCH Manton Center Fellowship et de la Little Giraffe Foundation (ZF), de la German Research Foundation (DFG; à BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH CRDI (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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