Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular
Summary
Este protocolo apresenta ensaio de brotos de choroide, um modelo ex vivo de proliferação microvascular. Este ensaio pode ser usado para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais e avaliar tratamentos medicamentosos usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.
Abstract
Angiogênese choroicular patológica, uma característica marcante da degeneração macular relacionada à idade, leva à deficiência visual e cegueira. Ensaios de proliferação de células endoteliais (CE) utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) ou CEs de retina primária isolada são amplamente utilizados em modelos in vitro para estudar angiogênese retinária. No entanto, isolar as células endoteliais da retina murina pura é tecnicamente desafiador e os CEs da retina podem ter respostas de proliferação diferentes das células endoteliais choroidais e diferentes interações celular/celular. Um ensaio altamente reprodutível ex vivo choroidal como modelo de proliferação microvascular choroidal foi desenvolvido. Este modelo inclui a interação entre vasculatura choroide (CE, macrófagos, pericílitos) e epitélio pigmento da retina (RPE). As explantas de RPE/coroid/scleral do mouse são isoladas e incubadas no extrato de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento (BME) (dia 0). O meio é trocado a cada dois dias e o broto de coroide é quantificado no dia 6. As imagens da explanta choroide individual são tiradas com um microscópio de fase invertida e a área de broto é quantificada usando um plug-in macro semi-automatizado para o software ImageJ desenvolvido neste laboratório. Este ensaio reprodutível de broto ex vivo choroidal pode ser usado para avaliar compostos para tratamento potencial e para pesquisas de doenças microvasculares para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.
Introduction
A desregulação da angiogênese choroidal está associada à degeneração macular relacionada à idade neovascular (DM)1. O coroide é um leito microvascular presente sob o epitélio pigmento da retina (RPE). Foi demonstrado que a redução do fluxo sanguíneo no coroide está associada à progressão da AMD2. A intrincada relação entre endotélio vascular, RPE, macrófagos, pericítos e outras células é responsável pela homeostase do tecido3,4,5. Portanto, um ensaio reprodutível modelando microambiente choroidal é fundamental para o estudo da AMD neovascular.
Ensaios ex vivo angiogênese e culturas celulares endoteliais in vitro podem complementar estudos de comportamento microvascular in vivo, para testes de novas drogas e para estudos de patogênese. Células endoteliais humanas como células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs), Células Endoteliais de Veia Umbilical Humana (HUVEC), cérebro animal primário isolado ou CEs da retina são frequentemente utilizadas em estudos in vitro para pesquisa de angiogênese ocular6,7,8. Os HRMECs, em particular, têm sido amplamente utilizados como modelo de neovascularização in vitro choroidal (CNV)9, avaliando a proliferação endotelial, migração, formação tubular e vazamento vascular para avaliar as intervenções6,10. No entanto, as CEs na cultura são limitadas como modelo de CNV devido à falta de interações com outros tipos de células encontradas no coroide e porque a maioria dos CE utilizados nesses ensaios não se originam do coroide. Os ECs de choroidal de rato são difíceis de isolar e manter na cultura.
O ensaio do anel aórtico é amplamente utilizado como modelo de proliferação macro vascular. Brotos vasculares de explantes aórticos incluem CES, pericítes e macrófagos11. O ensaio do anel aórtico modela angiogênese de vaso grande bem12,13,14. No entanto, tem limitações como modelo de neovascularização choroidal, pois os anéis aórticos são um tecido macrovascular que não tem o ambiente microvascular choroidal característico, e brotos de vasos grandes podem diferir de brotos de redes capilares envolvidas na patologia microvascular. Recentemente, um grupo publicou um ensaio ex-vivo retinal15,16. Embora seja adequado para doença neovascular da retina, não é tão apropriado para a neovascularização choroidal como visto na AMD.
O ensaio de broto de choroidal utilizando rpe rato, choroide e tecido escleral explantado foi desenvolvido para melhor modelar CNV. O tecido pode ser facilmente isolado dos olhos de camundongos (ou de outras espécies)17. Este ensaio permite a avaliação reprodutível do potencial pró e anti-angiogênico dos compostos farmacológicos e a avaliação do papel das vias específicas na neovascularização choroidal utilizando tecido de camundongos geneticamente modificados e controles18. Este ensaio de broto de choroidal foi referenciado em muitas publicações subsequentes9,10,18,19,20. Aqui, demonstram-se o método envolvido no uso deste ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de brotação de choroida ajuda a pesquisa em AMD neovascular9,10,18,19,20. Explantas choroides podem ser isoladas de camundongos, bem como ratos e humanos17,21. A explantação coroide inclui CES, macrófagos e pericítes17. Neste ensaio, a interação entre os CEs cho…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado por subsídios da Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children’s Hospital Ofthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship e Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; ao BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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