JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología

Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse

Published: October 27, 2020
doi:
10.3791/61720
, , , , , ,
1Department of Pharmacology,University of South Alabama, 2Center for Lung Biology,University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering,University of South Alabama

Summary

Vanwege de inherente lage signaal-ruisverhouding (SNR) van Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde sensoren, is het meten van cAMP-signalen een uitdaging geweest, vooral in drie ruimtelijke dimensies. Hier beschrijven we een hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysemethodologie die het mogelijk maakt om de cAMP-verdeling in drie ruimtelijke dimensies te meten.

Abstract

Cyclisch AMP is een tweede boodschapper die betrokken is bij een breed scala aan cellulaire en fysiologische activiteiten. Verschillende studies suggereren dat cAMP-signalen gecompartimenteerd zijn en dat compartimentering bijdraagt aan signaleringsspecificiteit binnen de cAMP-signaleringsroute. De ontwikkeling van op Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde biosensoren heeft het vermogen bevorderd om cAMP-signalen in cellen te meten en te visualiseren. Deze metingen zijn echter vaak beperkt tot twee ruimtelijke dimensies, wat kan resulteren in een verkeerde interpretatie van gegevens. Tot op heden zijn er slechts zeer beperkte metingen van cAMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies (x, y en z) geweest, vanwege de technische beperkingen bij het gebruik van FRET-sensoren die inherent een lage signaal-ruisverhouding (SNR) vertonen. Bovendien zijn traditionele filtergebaseerde beeldvormingsbenaderingen vaak niet effectief voor nauwkeurige meting van cAMP-signalen in gelokaliseerde subcellulaire gebieden vanwege een reeks factoren, waaronder spectrale overspraak, beperkte signaalsterkte en autofluorescentie. Om deze beperkingen te overwinnen en fret-gebaseerde biosensoren te kunnen gebruiken met meerdere fluoroforen, hebben we hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen ontwikkeld die spectrale specificiteit bieden voor het berekenen van FRET-efficiëntie en de mogelijkheid om FRET-signalen spectraal te scheiden van verstorende autofluorescentie en / of signalen van extra fluorescerende labels. Hier presenteren we de methodologie voor het implementeren van hyperspectrale FRET-beeldvorming, evenals de noodzaak om een geschikte spectrale bibliotheek te construeren die niet ondersampled of oversampled is om spectrale ontmenging uit te voeren. Terwijl we deze methodologie presenteren voor het meten van driedimensionale cAMP-verdelingen in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs), kan deze methodologie worden gebruikt om ruimtelijke verdelingen van cAMP in een reeks celtypen te bestuderen.

Introduction

Cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) is een tweede boodschapper die betrokken is bij belangrijke cellulaire en fysiologische processen, waaronder celdeling, calciuminstroom, gentranscriptie en signaaltransductie. Een groeiend aantal bewijzen suggereert het bestaan van cAMP-compartimenten in de cel waardoor signaleringsspecificiteit wordt bereikt1,2,3,4,5,6,7. Tot voor kort werd cAMP-compartimentering afgeleid op basis van verschillende fysiologische of cellulaire effecten geïnduceerd door verschillende G-gekoppelde receptoragonisten8,9,10,11. Meer recent hebben fret-gebaseerde fluorescentiebeeldvormingssondes nieuwe benaderingen geboden voor de directe meting en observatie van cAMP-signalen in een cel12,13,14.

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een fysisch fenomeen waarbij energieoverdracht plaatsvindt tussen donor- en acceptormoleculen op een niet-stralingsve manier wanneer de moleculen zich in de nabijheid bevinden15,16. Met de ontwikkeling van FRET-gebaseerde fluorescerende indicatoren is dit fysische fenomeen gebruikt in biologische toepassingen om eiwit-eiwitinteracties17,eiwitcolokalisatie18,Ca+2-signalering 19,genexpressie20,celdeling21 en cyclische nucleotidesignalering te bestuderen. FRET-gebaseerde cAMP-indicatoren bestaan doorgaans uit een cAMP-bindingsdomein, een donorfluoofoor en een acceptorfluoofoor22. De H188 cAMP-sensor12,22 die in deze methodologie wordt gebruikt, bestaat bijvoorbeeld uit een cAMP-bindingsdomein verkregen van Epac, ingeklemd tussen Turquoise (donor) en Venus (acceptor) fluoroforen. Bij basale omstandigheden (ongebonden) bevinden Turkoois en Venus zich in een zodanige oriëntatie dat FRET optreedt tussen de fluoroforen. Bij binding van cAMP aan het bindingsdomein treedt een conformatieverandering op die zodanig dat Turquoise en Venus uit elkaar bewegen, wat resulteert in een afname van FRET.

FRET-gebaseerde beeldvormingsbenaderingen bieden een veelbelovend hulpmiddel voor het onderzoeken en visualiseren van cAMP-signalen in een cel. De huidige op FRET gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn echter vaak slechts gedeeltelijk succesvol in het bereiken van voldoende signaalsterkte om FRET met subcellulaire ruimtelijke helderheid te meten. Dit komt door verschillende factoren, waaronder de beperkte signaalsterkte van veel FRET-verslaggevers, de hoge mate van precisie die nodig is om veranderingen in FRET-efficiëntie nauwkeurig te kwantificeren en de aanwezigheid van verstorende factoren, zoals cellulaire autofluorescentie23,24. Het resultaat is vaak een FRET-beeld dat wordt geplaagd door zwakke SNR, waardoor visualisatie van subcellulaire veranderingen in FRET erg moeilijk is. Bovendien is onderzoek naar ruimtelijk gelokaliseerde cAMP-signalen bijna uitsluitend uitgevoerd in slechts twee ruimtelijke dimensies en is de axiale cAMP-verdeling zelden beschouwd25. Dit komt waarschijnlijk omdat een lage SNR de mogelijkheid belemmerde om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Om beperkingen van het gebruik van FRET-sensoren met een lage SNR te overwinnen, hebben we hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen geïmplementeerd om FRET in afzonderlijke cellen te meten25,26,27.

Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen werden ontwikkeld door NASA om terrestrische objecten te onderscheiden die aanwezig zijn in satellietbeelden28,29. Deze technieken zijn sindsdien vertaald naar het fluorescentiemicroscopieveld30, met verschillende commerciële confocale microscoopsystemen die spectrale detectoren aanbieden. In traditionele (niet-spectrale) fluorescentiebeeldvorming wordt het monster geëxciteerd met behulp van een banddoorlaatfilter of een laserlijn en wordt de emissie verzameld met behulp van een tweede banddoorlaatfilter, vaak geselecteerd om overeen te komen met de piekemissiegolflengte van de fluorofoor (en). Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen daarentegen proberen een volledig spectraal profiel te bemonsteren van ofwel de fluorescentie-emissie26,31,32 of excitatie33,34 op specifieke golflengte-intervallen. In onze eerdere studies toonden we aan dat hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen een verbeterde kwantificering van FRET-signalen in cellen kunnen bieden in vergelijking met traditionele filtergebaseerde FRET-beeldvormingstechnieken26. Hier presenteren we een methodologie voor het uitvoeren van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse om cAMP-verdelingen in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Deze benaderingen hebben visualisatie van agonist-geïnduceerde cAMP ruimtelijke gradiënten in afzonderlijke cellen mogelijkgemaakt 25. Interessant is dat, afhankelijk van de agonist, cAMP-gradiënten zichtbaar kunnen zijn in cellen. De hier gepresenteerde methodologie maakt gebruik van spectrale ontmenging van niet-uniforme achtergrond en cellulaire autofluorescentie om de nauwkeurigheid van de FRET-metingen te verbeteren. Hoewel deze methodologie wordt gedemonstreerd in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs) met behulp van een cAMP FRET-biosensor, kan de methodologie gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met alternatieve FRET-reporters of alternatieve cellijnen.

Protocol

Dit protocol volgt procedures die zijn goedgekeurd door de University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Voorbereiding van cellen, monsters en reagens voor beeldvorming Isoleer pulmonale microvasculaire endotheelcellen van ratten (PMVEC’s) zoals eerder beschreven35.OPMERKING: Cellen werden geïsoleerd en gekweekt door de Cell Culture Core aan de Universiteit van South Alabama, Mobile, AL op 100 mm celkweekschalen. Za…

Representative Results

Dit protocol beschrijft het gebruik van hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies in levende cellen te meten. Er zijn verschillende belangrijke stappen betrokken bij het genereren van deze resultaten, waarvoor zorgvuldige aandacht vereist is bij het analyseren en kwantificeren van de gegevens. Deze belangrijke stappen omvatten de bouw van een geschikte spectrale bibliotheek, achtergrondspectraal onmenging, drempeling om celgrenzen te identificeren en FRET-…

Discussion

De ontwikkeling van FRET-biosensoren heeft de meting en visualisatie van cyclische nucleotidesignalen in afzonderlijke cellen mogelijk gemaakt, en er is een grote belofte voor het visualiseren van subcellulaire signaleringsgebeurtenissen13,22,37,38. Het gebruik van FRET-biosensoren vertoont echter verschillende beperkingen, waaronder de lage signaal-ruiskenmerken van veel op fluorescerende eiwi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen dr. Kees Jalink (Het Nederlands Kanker Instituut en van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederland) bedanken voor het leveren van de H188 cAMP FRET biosensor en Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) voor technische hulp bij het verkorten van de tijd die nodig is om onze op maat ontwikkelde programmeerscripts uit te voeren.

De auteurs willen graag de financieringsbronnen erkennen: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).

Tags

3D CAMP Distribution4D Hyperspectral FRET ImagingCyclic AMPFRETConfocal MicroscopySpectral Imaging3D Cell ImagingLive Cell ImagingTyrodes BufferNuclear LabelingLaser SettingsZ-stack Acquisition

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image