Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain
Summary
Nous décrivons ici une méthodologie facile à utiliser pour générer des réseaux de microtissus cardiaques auto-assemblés en 3D composés de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales prédé différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Cette technique conviviale et nécessitant des cellules basses pour générer des microtissus cardiaques peut être mise en œuvre pour la modélisation de la maladie et les premiers stades du développement de médicaments.
Abstract
La génération de cardiomyocytes humains (CM), de fibroblastes cardiaques (FC) et de cellules endothéliales (CE) à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) a fourni une occasion unique d’étudier l’interaction complexe entre différents types de cellules cardiovasculaires qui stimulent le développement tissulaire et la maladie. Dans le domaine des modèles de tissus cardiaques, plusieurs approches tridimensionnelles (3D) sophistiquées utilisent des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC-CM) pour imiter la pertinence physiologique et l’environnement tissulaire natif avec une combinaison de matrices extracellulaires et de réticulants. Cependant, ces systèmes sont complexes à fabriquer sans expertise en microfabrication et nécessitent plusieurs semaines pour s’auto-assembler. Plus important encore, beaucoup de ces systèmes manquent de cellules vasculaires et de fibroblastes cardiaques qui représentent plus de 60% des non-myocytes dans le cœur humain. Nous décrivons ici la dérivation des trois types de cellules cardiaques à partir des CSPi pour fabriquer des microtissus cardiaques. Cette technique de moulage de réplique facile permet la culture de microtissus cardiaques dans des plaques de culture cellulaire multi-puits standard pendant plusieurs semaines. La plate-forme permet un contrôle défini par l’utilisateur sur la taille des microtissus en fonction de la densité d’ensemencement initiale et nécessite moins de 3 jours pour l’auto-assemblage afin d’obtenir des contractions observables du microtissu cardiaque. En outre, les microtissus cardiaques peuvent être facilement digérés tout en maintenant une viabilité cellulaire élevée pour l’interrogation unicellulaire grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux et du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Nous envisageons que ce modèle in vitro de microtissus cardiaques aidera à accélérer les études de validation dans la découverte de médicaments et la modélisation de la maladie.
Introduction
La découverte de médicaments et la modélisation des maladies dans le domaine de la recherche cardiovasculaire sont confrontées à plusieurs défis en raison d’un manque d’échantillons cliniquement pertinents et d’outils translationnels inadéquats1. Les modèles précliniques très complexes ou les modèles unicellulaires in vitro trop simplifiés ne présentent pas de conditions physiopathologiques reproductibles. Par conséquent, plusieurs plates-formes miniaturisées d’ingénierie tissulaire ont évolué pour aider à combler l’écart, dans le but d’atteindre un équilibre entre la facilité d’application à haut débit et la récapitulation fidèle de la fonction tissulaire2,3. Avec l’avènement de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), les outils d’ingénierie tissulaire peuvent être appliqués à des cellules spécifiques au patient avec ou sans état de maladie cardiovasculaire sous-jacent pour répondre aux questions de recherche4,5,6. De tels modèles d’ingénierie tissulaire avec une composition cellulaire similaire au tissu cardiaque pourraient être utilisés dans les efforts de développement de médicaments pour tester la cardiotoxicité et le dysfonctionnement induits par des changements pathologiques dans le comportement d’un ou de plusieurs types de cellules.
Les microtissus ou organoïdes auto-assemblés dérivés d’iPSC humains sont des structures tridimensionnelles (3D) qui sont des assemblages miniatures ressemblant à des tissus présentant des similitudes fonctionnelles avec leurs homologues in vivo . Il existe plusieurs approches différentes qui permettent la formation d’organoïdes in situ via la différenciation dirigée des CSPi ou par la formation de corps embryoïdes4. Les organoïdes qui en résultent sont un outil indispensable pour étudier les processus morphogénétiques qui conduisent l’organogenèse. Cependant, la présence d’une variété de populations cellulaires et les différences d’auto-organisation peuvent entraîner une variabilité des résultats entre différents organoïdes5. Alternativement, les cellules prédé différenciées qui sont auto-assemblées en microtissus avec des types de cellules spécifiques aux tissus pour étudier les interactions cellules-cellules locales sont d’excellents modèles, où il est possible d’isoler les composants auto-assemblés. En particulier dans la recherche cardiaque humaine, le développement de microtissus cardiaques 3D avec des composants multicellulaires s’est avéré difficile lorsque les cellules sont dérivées de différentes lignées de patients ou de sources commerciales.
Pour améliorer notre compréhension mécaniste des comportements cellulaires dans un modèle in vitro physiologiquement pertinent et personnalisé, idéalement, tous les types de cellules constitutives devraient être dérivés de la même lignée de patients. Dans le contexte d’un cœur humain, un modèle cardiaque in vitro vraiment représentatif capturerait la diaphonie entre les types de cellules prédominants, à savoir les cardiomyocytes (CM), les cellules endothéliales (CE) et les fibroblastes cardiaques (FC)6,7. La récapitulation fidèle d’un myocarde nécessite non seulement un étirement biophysique et une stimulation électrophysiologique, mais également une signalisation cellule-cellule qui découle de types cellulaires de soutien tels que les CE et les CF8. Les FC sont impliqués dans la synthèse de la matrice extracellulaire et le maintien de la structure tissulaire; et dans un état pathologique, les FC peuvent induire une fibrose et altérer la conduction électrique dans les CMs9. De même, les CE peuvent réguler les propriétés contractiles des CM par la signalisation paracrine et l’approvisionnement en demandes métaboliques vitales10. Par conséquent, il est nécessaire que des microtissus cardiaques humains composés des trois principaux types de cellules permettent de mener des expériences à haut débit physiologiquement pertinentes.
Ici, nous décrivons une approche ascendante dans la fabrication de microtissus cardiaques par dérivation de cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC (iPSC-CM), de cellules endothéliales dérivées de l’iPSC (iPSC-EC) et de fibroblastes cardiaques dérivés de l’iPSC (iPSC-CFs) et leur culture 3D dans des réseaux de microtissus cardiaques uniformes. Cette méthode facile de génération de microtissus cardiaques spontanés peut être utilisée pour la modélisation de la maladie et le test rapide de médicaments pour la compréhension fonctionnelle et mécaniste de la physiologie cardiaque. En outre, de telles plateformes de microtissus cardiaque multicellulaires pourraient être exploitées avec des techniques d’édition du génome pour émuler la progression de la maladie cardiaque au fil du temps dans des conditions de culture chroniques ou aiguës.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour générer des microtissus cardiaques à partir d’iPSC-CM, d’iPSC-EC et d’iPSC-CF prédifférenciés, il est essentiel d’obtenir une culture très pure pour un meilleur contrôle du nombre de cellules après un compactage cellulaire inhibé par contact dans les microtissus cardiaques. Récemment, Giacomelli et. al.18 ont démontré la fabrication de microtissus cardiaques à l’aide d’iPSC-CM, d’iPSC-CE et d’iPSC-FC. Les microtissus cardiaques générés à l’aide de la métho…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Dre Amanda Chase pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Le financement a été fourni par le Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) de l’Université de Californie, T29FT0380 (D.T.) et 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) et 17MERIT33610009 (J.C.W.); et National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 et NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
Referencias
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