Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales
Summary
Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.
Abstract
La generación de cardiomiocitos humanos (CM), fibroblastos cardíacos (CF) y células endoteliales (CE) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha brindado una oportunidad única para estudiar la compleja interacción entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsa el desarrollo de tejidos y la enfermedad. En el área de los modelos de tejido cardíaco, varios enfoques tridimensionales sofisticados (3D) utilizan cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CM) para imitar la relevancia fisiológica y el entorno del tejido nativo con una combinación de matrices extracelulares y reticulantes. Sin embargo, estos sistemas son complejos de fabricar sin experiencia en microfabricación y requieren varias semanas para autoensamblarse. Lo más importante es que muchos de estos sistemas carecen de células vasculares y fibroblastos cardíacos que constituyen más del 60% de los no miocitos en el corazón humano. Aquí describimos la derivación de los tres tipos de células cardíacas a partir de iPSC para fabricar microtejidos cardíacos. Esta técnica de moldeo de réplica fácil permite el cultivo de microtinue cardíaco en placas de cultivo celular estándar de múltiples pocillos durante varias semanas. La plataforma permite el control definido por el usuario sobre los tamaños de microtejidos en función de la densidad de siembra inicial y requiere menos de 3 días para que el autoensamblaje logre contracciones observables de microtejidos cardíacos. Además, los microtejidos cardíacos se pueden digerir fácilmente mientras se mantiene una alta viabilidad celular para el interrogatorio de una sola célula con el uso de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Prevemos que este modelo in vitro de microtejidos cardíacos ayudará a acelerar los estudios de validación en el descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades.
Introduction
El descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades en el campo de la investigación cardiovascular se enfrentan a varios desafíos debido a la falta de muestras clínicamente relevantes y a herramientas traslacionales inadecuadas1. Los modelos preclínicos altamente complejos o los modelos unicelulares in vitro demasiado simplificados no presentan condiciones fisiopatológicas de manera reproducible. Por lo tanto, varias plataformas miniaturizadas de ingeniería tisular han evolucionado para ayudar a cerrar la brecha, con el objetivo de lograr un equilibrio entre la facilidad de aplicación de una manera de alto rendimiento y la recapitulación fiel de la función tisular2,3. Con el advenimiento de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), las herramientas de ingeniería de tejidos se pueden aplicar a células específicas del paciente con o sin estado de enfermedad cardiovascular subyacente para responder a las preguntas de investigación4,5,6. Tales modelos de ingeniería tisular con composición celular similar al tejido cardíaco podrían utilizarse en los esfuerzos de desarrollo de fármacos para probar la cardiotoxicidad y la disfunción inducidas por cambios patológicos en el comportamiento de uno o varios tipos de células.
Los microtejidos u organoides autoensamblados derivados de iPSCs humanas son estructuras tridimensionales (3D) que son ensamblajes en miniatura similares a tejidos que exhiben similitudes funcionales con sus contrapartes in vivo . Existen varios enfoques diferentes que permiten la formación de organoides in situ a través de la diferenciación dirigida de iPSCs o a través de la formación de cuerpos embrionarios4. Los organoides resultantes son una herramienta indispensable para estudiar los procesos morfogenéticos que impulsan la organogénesis. Sin embargo, la presencia de una variedad de poblaciones celulares y las diferencias en la autoorganización pueden conducir a la variabilidad en los resultados entre diferentes organoides5. Alternativamente, las células prediferenciadas que se autoensamblan en microtisajes con tipos de células específicas de tejidos para estudiar las interacciones célula-célula locales son excelentes modelos, donde es factible aislar los componentes autoensamblados. Particularmente en la investigación cardíaca humana, el desarrollo de microtejidos cardíacos 3D con componentes multicelulares ha demostrado ser un desafío cuando las células se derivan de diferentes líneas de pacientes o fuentes comerciales.
Para mejorar nuestra comprensión mecanicista de los comportamientos celulares en un modelo in vitro fisiológicamente relevante, personalizado, idealmente todos los tipos de células componentes deben derivarse de la misma línea de pacientes. En el contexto de un corazón humano, un modelo cardíaco in vitro verdaderamente representativo capturaría la diafonía entre los tipos de células predominantes, a saber, cardiomiocitos (CM), células endoteliales (CE) y fibroblastos cardíacos (CEF)6,7. La recapitulación fiel de un miocardio no solo requiere estiramiento biofísico y estimulación electrofisiológica, sino también señalización célula-célula que surge del soporte de tipos celulares como las CE y las CEF8. Los CF están involucrados en la síntesis de la matriz extracelular y el mantenimiento de la estructura del tejido; y en estado patológico, los CF pueden inducir fibrosis y alterar la conducción eléctrica en los CM9. Del mismo modo, las CE pueden regular las propiedades contráctiles de los CM a través de la señalización paracrina y el suministro de demandas metabólicas vitales10. Por lo tanto, existe la necesidad de microtejidos cardíacos humanos compuestos por los tres tipos principales de células para permitir que se realicen experimentos de alto rendimiento fisiológicamente relevantes.
Aquí, describimos un enfoque de abajo hacia arriba en la fabricación de microtejidos cardíacos mediante la derivación de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC (iPSC-CM), células endoteliales derivadas de iPSC (iPSC-EC) y fibroblastos cardíacos derivados de iPSC (iPSC-CFs) y su cultivo 3D en matrices de microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de generar microtejidos cardíacos que laten espontáneamente se puede utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas rápidas de medicamentos para la comprensión funcional y mecanicista de la fisiología del corazón. Además, tales plataformas de microtejidos cardíacos multicelulares podrían explotarse con técnicas de edición del genoma para emular la progresión de la enfermedad cardíaca a lo largo del tiempo en condiciones de cultivo crónicas o agudas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para generar microtejidos cardíacos a partir de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CC prediferenciados, es esencial obtener un cultivo altamente puro para un mejor control del número de células después de la compactación celular inhibida por contacto dentro de los microtejidos cardíacos. Recientemente, Giacomelli et. al.18 han demostrado la fabricación de microtejidos cardíacos utilizando iPSC-CMs, iPSC-ECs y iPSC-CFs. Los microtejidos cardíacos generados utilizando el método descrito consisten en …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Amanda Chase por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. El apoyo financiero fue proporcionado por el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco (TRDRP) de la Universidad de California, T29FT0380 (D.T.) y 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) y 17MERIT33610009 (J.C.W.); y National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 y NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
Referencias
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
