Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen
Summary
Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.
Abstract
Het genereren van menselijke cardiomyocyten (CMs), cardiale fibroblasten (CF’s) en endotheelcellen (EC’s) uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) heeft een unieke kans geboden om de complexe wisselwerking tussen verschillende cardiovasculaire celtypen te bestuderen die weefselontwikkeling en ziekte stimuleert. Op het gebied van hartweefselmodellen gebruiken verschillende geavanceerde driedimensionale (3D) benaderingen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) om fysiologische relevantie en inheemse weefselomgeving na te bootsen met een combinatie van extracellulaire matrices en crosslinkers. Deze systemen zijn echter complex om te fabriceren zonder microfabricage-expertise en vereisen enkele weken om zichzelf te assembleren. Het belangrijkste is dat veel van deze systemen geen vasculaire cellen en cardiale fibroblasten hebben die meer dan 60% van de niet-myocyten in het menselijk hart uitmaken. Hier beschrijven we de afleiding van alle drie de hartceltypen van iPSC’s om cardiale microtissues te fabriceren. Deze gemakkelijke replica molding techniek maakt cardiale microtissue cultuur in standaard multi-well cel kweekplaten gedurende enkele weken mogelijk. Het platform biedt door de gebruiker gedefinieerde controle over microtissuegroottes op basis van de initiële zaaidichtheid en heeft minder dan 3 dagen nodig voor zelfassemblage om waarneembare cardiale microtissue-contracties te bereiken. Bovendien kunnen de cardiale microtissues gemakkelijk worden verteerd met behoud van een hoge cel levensvatbaarheid voor eencellige ondervraging met behulp van flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq). We stellen ons voor dat dit in vitro model van cardiale microtissues zal helpen bij het versnellen van validatiestudies in medicijnontdekking en ziektemodellering.
Introduction
Geneesmiddelenontdekking en ziektemodellering op het gebied van cardiovasculair onderzoek worden geconfronteerd met verschillende uitdagingen als gevolg van een gebrek aan klinisch relevante monsters en ontoereikende translationele hulpmiddelen1. Zeer complexe preklinische modellen of overgesimplificeerde in vitro eencellige modellen vertonen geen pathofysiologische omstandigheden op een reproduceerbare manier. Daarom zijn verschillende geminiaturiseerde weefselmanipulatieplatforms geëvolueerd om de kloof te helpen overbruggen, met als doel een balans te bereiken tussen gebruiksgemak op een manier met hoge doorvoer en getrouwe recapitulatie van weefselfunctie2,3. Met de komst van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) kunnen tissue engineering-instrumenten worden toegepast op patiëntspecifieke cellen met of zonder onderliggende cardiovasculaire hartziekte om onderzoeksvragen te beantwoorden4,5,6. Dergelijke weefselmanipulatiemodellen met cellulaire samenstelling vergelijkbaar met het hartweefsel kunnen worden gebruikt bij de ontwikkeling van geneesmiddelen om te testen op cardiotoxiciteit en disfunctie veroorzaakt door pathologische gedragsveranderingen van een of meerdere celtypen.
Zelfgeassembleerde microtissues of organoïden afgeleid van menselijke iPSC’s zijn driedimensionale (3D) structuren die miniatuur weefselachtige assemblages zijn die functionele overeenkomsten vertonen met hun in vivo tegenhangers. Er zijn verschillende benaderingen die de vorming van organoïden in situ mogelijk maken via gerichte differentiatie van iPSC’s of door de vorming van embryoïde lichamen4. De resulterende organoïden zijn een onmisbaar hulpmiddel om morfogenetische processen te bestuderen die de organogenese aansturen. De aanwezigheid van een verscheidenheid aan celpopulaties en verschillen in zelforganisatie kunnen echter leiden tot variabiliteit in uitkomsten tussen verschillende organoïden5. Als alternatief zijn vooraf gedifferentieerde cellen die zelf geassembleerd zijn tot microtissues met weefselspecifieke celtypen om lokale cel-celinteracties te bestuderen uitstekende modellen, waarbij het mogelijk is om de zelfgeassembleerde componenten te isoleren. Met name in menselijk cardiaal onderzoek is de ontwikkeling van 3D-cardiale microtissues met meercellige componenten een uitdaging gebleken wanneer cellen zijn afgeleid van verschillende patiëntenlijnen of commerciële bronnen.
Om ons mechanistisch begrip van celgedrag in een fysiologisch relevant, gepersonaliseerd, in vitro model te verbeteren, moeten idealiter alle componentceltypen worden afgeleid van dezelfde patiëntenlijn. In de context van een menselijk hart zou een echt representatief cardiaal in vitro model de overspraak tussen overheersende celtypen vastleggen, namelijk cardiomyocyten (CMs), endotheelcellen (EC’s) en cardiale fibroblasten (CF’s)6,7. De getrouwe recapitulatie van een myocardium vereist niet alleen biofysische rek en elektrofysiologische stimulatie, maar ook cel-celsignalering die ontstaat uit ondersteunende celtypen zoals EC’s en CF’s8. CF’s zijn betrokken bij de synthese van extracellulaire matrix en het behoud van de weefselstructuur; en in pathologische toestand kunnen CF’s fibrose induceren en de elektrische geleiding in de CM’s veranderen9. Evenzo kunnen EC’s contractiele eigenschappen van CM’s reguleren door paracriene signalering en het leveren van vitale metabolische eisen10. Daarom is er behoefte aan menselijke cardiale microtissues die zijn samengesteld uit alle drie de belangrijkste celtypen om fysiologisch relevante high-throughput experimenten uit te voeren.
Hier beschrijven we een bottom-up benadering in de fabricage van cardiale microtissues door afleiding van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs), iPSC-afgeleide endotheelcellen (iPSC-EC’s) en iPSC-afgeleide cardiale fibroblasten (iPSC-CFs) en hun 3D-cultuur in uniforme cardiale microtissue-arrays. Deze gemakkelijke methode voor het genereren van spontaan kloppende cardiale microtissues kan worden gebruikt voor ziektemodellering en het snel testen van geneesmiddelen voor functioneel en mechanistisch begrip van hartfysiologie. Bovendien kunnen dergelijke meercellige cardiale microtissueplatforms worden benut met genoombewerkingstechnieken om de progressie van hartaandoeningen in de loop van de tijd na te bootsen onder chronische of acute kweekomstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om cardiale microtissues te genereren uit vooraf gedifferentieerde iPSC-CMs, iPSC-EC’s en iPSC-CFs, is het essentieel om een zeer zuivere cultuur te verkrijgen voor een betere controle van het aantal cellen na contact-geremde celverdichting in de cardiale microtissues. Onlangs heeft Giacomelli et. al.18 hebben de fabricage van cardiale microtissues aangetoond met behulp van iPSC-CMs, iPSC-EC’s en iPSC-CFs. Cardiale microtissues gegenereerd met behulp van de beschreven methode bestaan uit ~ 5.000 c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Dr. Amanda Chase voor haar nuttige feedback op het manuscript. Financieringssteun werd verstrekt door het Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) van de Universiteit van Californië, T29FT0380 (D.T.) en 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) en 17MERIT33610009 (J.C.W.); en National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 en NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
Referencias
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
