Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.
Abstract
Le mosche di sabbia sono i vettori naturali per le specie di Leishmania, i parassiti protozoici che producono un ampio spettro di sintomi che vanno dalle lesioni cutanee alla patologia viscerale. Decifrare la natura delle interazioni vettore/parassita è di primaria importanza per una migliore comprensione della trasmissione della Leishmania ai loro ospiti. Tra i parametri che controllano la competenza del vettore della mosca della sabbia (cioè la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni), i parametri intrinseci a questi insetti hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave. La risposta immunitaria degli insetti, ad esempio, influisce sulla competenza vettoriale della mosca della sabbia in Leishmania. Lo studio di tali parametri è stato limitato dalla mancanza di metodi di modifica dell’espressione genica adattati per l’uso in questi organismi non modello. La downregolazione genica da parte di un piccolo RNA interferente (siRNA) è possibile, ma oltre ad essere tecnicamente impegnativa, il silenziamento porta solo a una perdita parziale della funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione. La mutagenesi mirata della tecnologia CRISPR/Cas9 è stata recentemente adattata alla mosca di sabbia Phlebotomus papatasi. Questa tecnica porta alla generazione di mutazioni trasmissibili in un luogo appositamente scelto, permettendo di studiare i geni di interesse. Il sistema CRISPR/Cas9 si basa sull’induzione di rotture mirate di DNA a doppio filamento, successivamente riparate da NHEJ (Non-Homologous End Joining) o da Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consiste in una semplice chiusura dell’interruzione e spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. Al contrario, l’HDR utilizza la presenza di una molecola di DNA donatore che condivide l’omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Qui, presentiamo un metodo di microiniezione embrionale mosca di sabbia per la mutagenesi mirata da PARTE di CRISPR / Cas9 utilizzando NHEJ, che è l’unica tecnica di modifica del genoma adattata ai vettori di mosca della sabbia fino ad oggi.
Introduction
Le malattie trasmesse da vettori sono una delle principali minacce per la salute pubblica in costante evoluzione. Centinaia di specie vettoriali diffuse in famiglie filogeniche molto distinte (ad esempio, zanzare, zecche, pulci) sono responsabili della trasmissione di un numero enorme di agenti patogeni microbici, causando più di 700.000 morti umane all’anno, secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità. Tra gli insetti vettoriali, le mosche di sabbia flebotomina (Diptera, Psychodidae) costituiscono un vasto gruppo, con 80 specie vettoriali comprovate che mostrano tratti fenotipici distinti e capacità vettoriali presenti in diverse regioni geografiche. Sono vettori per i parassiti protozoi del genere Leishmania, causando circa 1,3 milioni di nuovi casi di leishmanie e tra i 20.000 e i 30.000 morti all’anno. Gli esiti clinici delle leishmanie sono diversi, con sintomi che vanno dalle lesioni cutanee autolimitanti alla diffusione viscerale che è fatale in assenza di trattamento.
Le mosche di sabbia sono insetti strettamente terrestri. Il loro ciclo di vita, relativamente lungo rispetto ad altri Ditteri, dura fino a tre mesi, a seconda di diversi parametri come temperatura, umidità e nutrizione. Consiste in uno stadio embrionale (da 6 a 11 giorni), quattro stadi larvali (della durata totale di 23-25 giorni) e uno stadio pupale (da 9 a 10 giorni) seguito da metamorfosi e poi età adulta. Le mosche di sabbia richiedono un ambiente umido e caldo per l’allevamento. Sia i maschi che le femmine si nutrono di zuccheri, ottenuti in natura dai nettari di fiori. Solo le femmine sono emoderivatrici, in quanto richiedono proteine ottenute dalla farina di sangue per la produzione di uova1.
Un obiettivo importante della ricerca è identificare la natura delle interazioni vettore / parassita che portano allo sviluppo di infezioni trasmissibili. Come per altri insetti vettoriali, i parametri intrinseci alle mosche di sabbia hanno dimostrato di influire sulla loro competenza vettoriale, che è definita come la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni ai loro ospiti. Ad esempio, l’espressione delle galectine da parte delle cellule di phlebotomus papatasi sand fly midgut, agendo come recettori che riconoscono i componenti della superficie parassitaria, può influenzare direttamente la loro competenza vettoriale per la Leishmania major2,3. La via di risposta immunitaria degli insetti, ImmunoDeficiency (IMD), è anche cruciale per la competenza del vettore di mosca della mosca della sabbia Phlebotomus papatasi per Leishmania major4. Un ruolo critico per le vie di risposta immunitaria degli insetti vettoriali nel controllo della loro trasmissione di agenti patogeni infettivi è stato segnalato in modo simile nelle zanzare Aedes aegypti 5,6,7, nella mosca tse-tse Glossina morsitans8e nelle zanzare Gambiae Anopheles 9,10.
Gli studi sulle interazioni mosca di sabbia /Leishmania sono stati limitati dalla mancanza di metodi di modifica dell’espressione genica adattati per l’uso in questi insetti. Solo la downregolazione genica da parte di piccoli RNA interferenti (siRNA) erastata eseguita 11,12,13,14 fino a poco tempo fa. La tecnica, limitata dalla mortalità associata alla microiniezione delle femmine adulte, porta solo a una parziale perdita di funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione.
La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la ricerca genomica funzionale in organismi non modello come le mosche della sabbia. Modificato dal sistema immunitario adattivo nei procarioti per la difesa contro i batteriofagi15,16, il sistema CRISPR Cas9 è stato rapidamente adattato come strumento di modifica del genoma per organismi eucarioti superiori, compresi gli insetti. Il principio dell’editing mirato del genoma CRISPR/Cas9 si basa sulla complementarietà di un singolo RNA guida (sgRNA) a uno specifico locus genomico. La nucleasi Cas9 si lega allo sgRNA e crea una rottura del DNA a doppio filamento (dsDNA) nel DNA genomico in cui lo sgRNA si associa alla sua sequenza complementare. Il complesso Cas9-sgRNA è guidato alla sequenza bersaglio da 17 a 20 basi complementari nello sgRNA al locus scelto, la rottura dsDNA può quindi essere riparata da due percorsi indipendenti: giunzione finale non omologa (NHEJ) o riparazione diretta dall’omologia (HDR)17. La riparazione NHEJ comporta una semplice chiusura dell’interruzione, ma spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. La riparazione del DNA attraverso l’HDR utilizza una molecola di DNA donatore che condivide l’omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Gli insetti possiedono entrambi i macchinari.
La tecnologia CRISPR/Cas9 può generare mutazioni in un luogo scelto, attraverso la via di riparazione NHEJ; o per strategie di editing del genoma più complesse, come knock-in o giornalisti di espressioni, attraverso il percorso HDR con un modello di donatore appropriato. Nelle mosche di sabbia, gli alleli mutanti nulli del fattore di risposta immunitaria Relish sono stati generati attraverso CRISPR mediato da NHEJ in Phlebotomus papatasi4. Gli embrioni di mosca della sabbia sono stati iniettati anche in un altro studio con un mix CRISPR / Cas9 che prende di mira il gene che codifica giallo. Tuttavia, nessun adulto portatore della mutazione è statoprodotto 18. Descriviamo qui un metodo dettagliato di mutagenesi mirata della mosca della sabbia da CRISPR/Cas9 mediata da NHEJ, con particolare attenzione alla microiniezione embrionale, una fase critica del protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentiamo qui un metodo di microiniezione embrionale recentemente sviluppato per la mutagenesi mirata di CRISPR/Cas9 in mosche di sabbia Phlebotomus papatasi. La microiniezione embrionale per la modificazione genetica degli insetti è stata sviluppata in Drosophila a metà degli anni’80 21 ed è ora regolarmente utilizzata in un’ampia varietà di insetti. Altri metodi per la consegna di materiali di modificazione genetica sono stati sviluppati per l’uso negli insetti, come ReMO…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Vanessa Meldener-Harrell per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
Referencias
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