샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입
Summary
이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.
Abstract
모래 파리는 리슈마니아 종, 원생 동물 기생충에 대 한 자연 벡터 피부 병 변에서 내장 병 리 에 이르기까지 증상의 광범위 한 스펙트럼을 생산. 벡터/기생충 상호 작용의 본질을 해독하는 것은 그들의 호스트에 Leishmania 전송의 더 나은 이해를 위한 1차적인 중요성입니다. 모래 플라이 벡터 역량(즉, 병원체를 운반하고 전송하는 능력)을 제어하는 파라미터 중에서도 이러한 곤충에 내재된 파라미터가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 곤충 면역 반응은 예를 들어, 리슈마니아에모래 플라이 벡터 능력에 영향을 미친다. 이러한 매개 변수의 연구는 이러한 비모델 유기체에서 사용하기 위해 적응된 유전자 발현 변형 방법의 부족에 의해 제한되었다. 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 다운 조절은 가능하지만 기술적으로 도전적일 뿐만 아니라 침묵은 세대에서 세대로 전염될 수 없는 기능의 부분적인 손실로 이어집니다. CRISPR/Cas9 기술에 의한 표적 돌연변이 발생은 최근에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에 적응되었습니다. 이 기술은 관심있는 유전자를 공부할 수 있도록, 특별히 선택된 궤적에 있는 전송 가능한 돌연변이의 생성으로 이끌어 냅니다. CRISPR/Cas9 시스템은 대상 이중 가닥 DNA 휴식의 유도에 의존하며, 나중에 비동호모로우스 엔드 인게이션(NHEJ) 또는 호모로지 구동 수리(HDR)에 의해 수리됩니다. NHEJ는 휴식의 간단한 폐쇄로 구성되어 있으며 종종 작은 삽입 / 삭제 이벤트로 이어집니다. 대조적으로, HDR은 기증자 DNA 분자가 표적 DNA와 상동성을 수리가 위한 템플릿으로 사용하는 것을 이용합니다. 여기서, 현재까지 모래파리 벡터에 적응된 유일한 게놈 변형 기술인 NHEJ를 사용하여 CRISPR/Cas9에 의한 표적 돌연변이 발생을 위한 모래플라이 배아 미세주입 방법을 제시한다.
Introduction
벡터 매개 질병은 지속적인 진화의 주요 공중 보건 위협입니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 수백 종의 벡터 종들이 매우 뚜렷한 물리학 상가(예: 모기, 진드기, 벼룩)의 엄청난 수의 미생물 병원체 의 전염에 책임이 있으며, 이로 인해 연간 70만 명 이상의 인명 사망이 발생한다고 합니다. 벡터 곤충 중, 플레보토민 모래 파리 (Diptera, Psychodidae)는 다른 지리적 지역에서 발견 된 뚜렷한 현상 특성과 벡터 용량을 나타내는 80 입증 된 벡터 종과 함께 광대 한 그룹을 구성합니다. 그(것)들은 사이 20,000그리고 30,000죽음 사이 Leishmanias의 약 130만의 새로운 케이스를 일으키는 원인이 되는 속 Leishmania의원생동물 기생충을 위한 벡터입니다. Leishmaniases 임상 결과는 다양합니다, 치료의 부재에서 치명적인 내장 보급에 자기 제한 적인 경골 병변에서 구역 수색에 이르기까지 현상으로.
모래 파리는 엄격하게 지상파 곤충입니다. 그들의 수명 주기, 다른 Diptera에 비해 상대적으로 긴, 온도 등 다른 매개 변수에 따라 최대 3 개월 지속, 습도, 그리고 영양. 그것은 1개의 배아 단계 (6 11 일), 4개의 애벌레 단계 (총 23 에서 25 일 지속) 및 1개의 pupal 단계 (9 10 일) 그 후에 변질 및 그 후에 성인으로 이루어져 있습니다. 모래 파리는 사육을 위해 습하고 따뜻한 환경이 필요합니다. 남성과 여성 모두 꽃 꿀에서 야생에서 얻은 설탕을 먹습니다. 오직 여성만이 혈액 공급제이며, 계란 생산을 위해 혈액 식사에서 얻은 단백질을 필요로 하기 때문에1.
연구의 중요한 초점은 전염성 감염의 발달로 이끌어 내는 벡터/기생충 상호 작용의 본질을 확인하는 것입니다. 다른 벡터 곤충과 마찬가지로, 모래 파리에 본질적인 매개 변수는 그들의 벡터 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다., 그들의 호스트에 병원체를 운반 하 고 전송 하는 그들의 능력으로 정의. 예를 들어, 플레보토무스 파파타시 모래에 의한 갈렉틴의 발현은 기생충 표면 성분을 인식하는 수용체역할을 하는 미드구트 세포를 비행하며, 리슈마니아 전공2,3에대한 벡터 역량에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 곤충 면역 반응 경로, 면역 결핍 (IMD), 또한 Leishmania 주요4에대 한 Phlebotomus 파파타시 모래 플라이 벡터 능력에 대 한 중요 한. 전염하는 병원체의 전염을 조절하는 벡터 곤충 면역 반응 경로에 대한 중요한 역할은 Aedes aegypti 모기5,6,7,체셋 플라이 글로시나 모시탄8,및 아노펠스 감비아 모기9,10에서유사하게 보고되었다.
모래 파리/Leishmania 상호 작용의 연구는 이 곤충에 사용하기 위해 적응된 유전자 발현 수정 방법의 부족에 의해 제한되었습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 유전자 다운조절만은 최근까지11,12,13,14를 수행하였다. 이 기술은 성인 여성의 미세 주입과 관련된 사망률에 의해 제한되며, 세대에서 세대로 전염될 수 없는 기능의 부분적인 손실로만 이어집니다.
CRISPR/Cas9 기술은 모래 파리와 같은 비모델 유기체에서 기능성 게놈 연구에 혁명을 일으켰습니다. 세균제에대한 방어를 위한 대핵생물의 적응형 면역 계통으로부터 변형된 CRISPR Cas9 시스템은 곤충을 포함한 우수한 진핵생물을 위한 게놈 편집 도구로 빠르게 적응되고 있다. CRISPR/Cas9 표적 게놈 편집의 원리는 특정 게놈 궤적에 대한 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 상호 보완성을 기반으로 합니다. Cas9 핵은 sgRNA에 결합하고 sgRNA가 그것의 보완적인 순서와 연관되는 게놈 DNA에 있는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 중단을 만듭니다. Cas9-sgRNA 복합체는 SgRNA에서 17~20개의 상호 보완염기까지 표적 서열로 유도되며, dsDNA 브레이크는 두 개의 독립적인 경로에 의해 수리될 수 있다: 비homologous 엔드 결합(NHEJ) 또는 호모로지 지향 수리(HDR)17. NHEJ 수리는 휴식의 간단한 폐쇄를 포함하지만 자주 작은 삽입 / 삭제 이벤트로 이어질. HDR을 통한 DNA 복구는 기증자 DNA 분자가 표적 DNA와 상동성을 수리하기 위한 템플릿으로 사용합니다. 곤충은 두 기계를 모두 보유하고 있습니다.
CRISPR/Cas9 기술은 NHEJ 수리 경로를 통해 선택한 궤적에서 돌연변이를 생성할 수 있습니다. 또는 적절한 기증자 템플릿이 있는 HDR 경로를 통해 노크 인 또는 발현 기자와 같은 보다 복잡한 게놈 편집 전략을 위해. 모래 파리에서, 면역 반응 인자의 null 돌연변이 알렐레는 Phlebotomus 파파타시4에서NHEJ 매개 CRISPR을 통해 생성되었다. 모래 플라이 배아는 또한 CRISPR/Cas9 혼합으로 또 다른 연구에서 주입되었다 노란색을 인코딩 하는 유전자를 대상으로. 그럼에도 불구하고 돌연변이를 운반하는 성인은18을생산하지 않았다. 우리는 여기에서 NHEJ 매개 CRISPR/Cas9에 의한 표적 돌연변이 발생의 상세한 방법을 설명하고, 특히 프로토콜의 중요한 단계인 배아 미세 주입에 중점을 둡니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에서 CRISPR / Cas9에 의해 표적 돌연변이 발생을위한 최근에 개발 된 배아 미세 주입 방법을 제시한다. 곤충 유전자 변형을 위한 배아 미세주입은 1980년대 중반에 드로소필라에서 개발되었으며 현재 다양한 곤충에서 일상적으로 사용되고 있다. 유전자 변형 물질의 전달을 위한 다른 방법은 ReMOT20,<sup class="xr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 원고의 비판적 독서에 대한 바네사 멜데너 – 해럴에게 감사드립니다.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
Referencias
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