CRISPR/Cas9 使用dpy-10联合 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物编辑C. elegans rbm-3.2基因。

Summary

此协议的目标是使用组装的核糖核蛋白复合物和dpy-10共同 CRISPR 标记进行无缝的 CRISPR/Cas9 编辑，以便进行筛选。 此协议可用于在C. elegans中进行各种基因修改，包括插入、删除、基因替换和 codon 替代。

Abstract

研究人员利用细菌聚集定期间短白细胞重复（CRISPR）/链球菌PYogenesCRISPR相关蛋白质（Cas）系统来研究重要的生物学相关问题。CRISPR/Cas基因组编辑方法的无与伦比的力量使研究人员能够精确编辑他们选择的任何部位，从而促进对基因功能的了解。以前曾描述过由CRISPR/Cas9编辑C.elegans基因组的几种方法。在这里，我们讨论和演示一种方法，利用体外组装的核糖核蛋白复合物和dpy-10共同CRISPR标记进行筛选。具体来说，在本文中，我们通过同源定向修复，使用CRISPR/Cas9编辑方法，逐步将过早停止的codon引入C.elegans rbm-3.2基因。这种相对简单的编辑方法可用于研究任何感兴趣的基因的功能，并允许CRISPR/Cas9编辑在不到两周的时间内生成同源编辑的C.elegans。

Introduction

聚类定期间歇性短白细胞重复（CRISPR）/链球菌皮质CRISPR相关蛋白质（Cas）技术能够在各种生物体^{1，2，3，4}中实现高效的靶向基因组编辑。CRISPR系统最初被发现作为原病毒抗病毒免疫反应^5，6，7的一部分。II 型 CRISPR 系统使用内窥酮夹板，如 Cas9， 转活RNA（跟踪RNA）和短，目标DNA特异性20核苷酸长导CRISPRRNA（crRNA）识别”NGG”原位空间相邻的Motif（PAM），并在目标^{DNA5，6，7，8，9，10，11，12}双链断裂。这种双链断裂被细胞DNA修复机械确认为病变。因此，生成的双链断裂可以通过两个路径之一修复 – i） 非同源端连接 （NHEJ） 或 ii） 同源定向修复 （HDR）^13。NHEJ 经常容易出错，因此，当此通路用于修复目标 DNA 中的双链断裂时，它通常会导致感兴趣的基因中灭活突变（插入、删除）。另一方面，通过向双链断裂的两侧提供具有同源性外源修复模板，细胞DNA修复机械可以指示使用 HDR 修复断裂^13。因此，HDR 方法能够精确编辑任何感兴趣的地点。

各种CRISPR/Cas9基因编辑协议已经描述了C.elegans14，15，16，17，18，19，20。在C.elegans最常用的CRISPR/Cas9编辑方法包括基于克隆和无克隆的协议，以生成CRISPR/Cas9编辑14，15，16，17，18，19，20的修复模板。本协议详细讨论了基于使用dpy-10作为筛选共同 CRISPR 标记的无克隆 CRISPR/Cas9 编辑协议。到目前为止，唯一详细的C.elegans为重点的CRISPR/Cas9编辑视频协议存在使用荧光标记筛选^21。然而，使用荧光标记进行筛查需要使用荧光显微镜，小型本科院校 （PUI） 的许多实验室可能发现很难访问荧光显微镜。令人鼓舞的是，在先前的研究中，携带荧光标记的蠕虫与^{编辑21、22}的存在之间取得了积极的相关^结果。但是，需要进行额外的研究，以确定基于荧光的筛选方法的整体效率，以便使用不同的指南RNA和修复模板编辑各种 loci。最后，由于这些荧光标记的质粒编码形成外色体阵列，变荧光通常由这些阵列产生，使阳性难以识别^23。因此，虽然基于荧光的筛选方法可能很有用，但上述问题可能会限制其适用性。

使用产生可见表型的共CRISPR标记，可大大减少需要筛选的后代数量，以找到积极编辑的蠕虫23，24，25，26，27，28。重要的是，这些标记产生的表型很容易在简单的解剖显微镜下检测到23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34。dpy-10共CRISPR标记是性能最佳和广泛使用的共CRISPR标记之一，用于执行C.埃莱甘SCRISPR/Cas9基因组编辑^24，27。 因此，本文将讨论使用直接交付核糖核蛋白复合物与dpy-10作为共同CRISPR标记^27，35在C.elegans执行CRISPR/Cas9编辑的方法。在这种方法中，准备的编辑注射组合包括一个特征良好的dpy-10 crRNA和dpy-10修复模板，以调解一个可观察到的显性”滚筒”（Rol）表型的生成，这是由已知的异质dpy-10（cn64）突变在dpy-10基因24，27，29。当存在同源状态时，dpy-10（cn64）突变会导致一种垃圾（dpy）表型，从而产生更短和更笨重的蠕虫24，29。Rol 表型通过 HDR 介导的 CRISPR/Cas9 编辑将共同提供的dpy-10修复模板准确插入dpy-10基因的单个副本进行介导。因此，Rol C. elegans的出现表明注射成功，以及注射蠕虫细胞内成功进行 HDR 介质编辑事件。由于目标基因的 crRNA 和修复模板与dpy-10 crRNA 和dpy-10修复模板处于相同的注射组合中，因此确定的 Rol 蠕虫很有可能也同时在感兴趣的目标基因上进行编辑。因此，这些 Rol 蠕虫随后通过聚合酶链式反应 （PCR） （用于大于 50 bp 的编辑） 或 PCR，然后是限制消化（用于小于 50 bp 的编辑）等技术筛选出感兴趣的编辑。

使用这种方法进行基因组编辑的优点是：（一）CRISPR编辑可以以相对较高的效率（2%至70%）使用这种方法^产生27：ii） 本方法中使用的修复模板和指南RNA不涉及克隆，从而缩短了其生成所需的时间：iii） 通过在体外组装核糖核蛋白复合物，可以保持组装编辑复合物的浓度相对恒定，从而提高可重复性：iv） 一些指南RNA，当从质粒表达时无法生成编辑已被证明适用于CRISPR/Cas9基因组编辑时，提供体外转录crnas²⁷：v） 包括dpy-10共 CRISPR 标记，便于使用解剖显微镜进行筛查，并减少必须筛查的后代数量，以找到阳性^24、27：和vi）DNA测序验证同源编辑蠕虫线可以通过这种方法在几周内^{获得19，27。}

与许多不同的C.elegansCRISPR方法有关的优秀书籍章节已经出版^{了14，15，16，17，18，19，20，43。}然而，目前缺乏在实验室环境中以视频格式演示dpy-10共同 CRISPR 方法。在本文中，我们描述并演示了使用dpy-10共 CRISPR 方法编辑一种名为rbm-3.2的代表性目标基因的过程，该基因是一种假定RNA结合蛋白（蠕虫基：https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10）。 具体来说，在这里，我们详细描述了使用体外组装的核糖核蛋白复合物和外源性提供的线性单链修复模板，在C.elegans rbm-3.2基因中引入三个过早停止胶点的方法。这些研究已经成功地产生了第一个C.elegansCRISPR菌株与过早停止在rbm-3.2基因。由于目前对这种基因在C.elegans中的功能知之甚少，这种菌株将成为解剖人民币-3.2功能的有用工具。这种方法也可以在C.elegans基因组中的任何位点进行插入、替换和删除。

Protocol

根据NIH指南，塔尔萨大学机构生物安全委员会批准了这一CRISPR/Cas9基因组编辑方案。在整个协议中，采用了无菌技术。本协议的所有步骤均使用无核酸酶的试剂执行。特别注意防止 RNase 污染，如清洁手套以及工作空间和设备（如移液器、玻璃器皿外部等），并采用 RNase 净化溶液。 1. crRNA 设计 查找使 Cas9 能够切割到最接近编辑站点的 PAM。 PAM 站点为 5′-NGG-3’。 请记住，PAM 可以在 DNA 的任何一条链上。 在 PAM 的 5′ 末端选择 20 个基点作为 crRNA 序列。注：由商业公司合成的实际 crRNA 序列超过 20 bp，因为它具有额外的通用序列，由合成公司自动添加到目标特定的 20 bp crRNA 序列中。关于目标外效应，最近的研究没有发现Cas9在C.elegans36，37，38，39，40的偏离目标的影响。此外，由此产生的CRISPR编辑的菌株被超越。因此，我们并不十分关注所设计的 crRNA 的偏离目标的影响。然而，在线网站，包括 http://genome.sfu.ca/crispr/ 和 http://crispor.tefor.net/ 可用于查找和选择具有最小偏离目标效果38，41的créRNA。crRNA，以G或GG结束和那些超过50%的GC含量预计将更高效19，23，42。 从公司订购至少 10 nmol 的 crrna （例如 IDT、 地平线发现等） 。 一旦冻血性 crRNA 到达，将其存储在 -30°C，直到微注射的一天。 在执行微喷射的当天，以最大速度（17，000 x g）旋转冻血球核糖核酸一分钟，并将其重新插入 5 m M Tris-Cl （pH 7.4），以制作 8 μg/μL 的 crRNA 库存。 将未使用的 crRNA 库存冻结在 -80 °C 下。 2. 维修模板设计 下载序列操作软件（例如 CLC 序列查看器、APE、快照、矢量 NTI 等）。我们使用 CLC 序列查看器版本 8.0 （Qiagen），因为它对用户友好，可以免费下载。 将感兴趣的目标DNA序列粘贴到序列查看器中。 修复模板的方向影响编辑效率28。要将修复序列插入 PAM 的 5′ 端，设计一个单链修复模板，该模板与来自 PAM 序列所在的同一 DNA 链（原空间链）28的 DNA 序列。而插入修复序列到PAM的3’末端，设计一个单链修复模板与DNA链的DNA序列，不携带PAM序列（间隔链）28。 选择 35 个基本对序列，编辑的两侧（在 5′ 和 3′ 末端）具有不间断的同源性。 变异或删除 PAM 以防止 Cas9 切割修复模板或编辑的基因组 DNA。 如果不可能进行 PAM 突变，则在 PAM 的 5′ 末端引入几个静音突变，以防止切割修复模板或经过编辑的基因组 DNA。 确保只有在 PAM 存在于外波区域时才会引入无声突变。 检查 codon 使用频率，以确保变异的鳕鱼以与原始非突变鳕鱼（例如 https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table）相媲美的频率引入。在某些情况下，可能无法以与未突变的鳕鱼相似的频率引入变异的鳕鱼。然而，对于一些氨基酸的突变，我们预计突变蛋白的表达水平不会显著改变。 如果编辑量很小（例如几个碱基的突变），则引入一个靠近静音突变编辑的独特限制站点。我们使用 http://heimanlab.com/cut2.html 来查找可以通过静音突变引入的限制站点。 检查鳕鱼使用频率，以确保变异的鳕鱼以与原始非突变鳕鱼相媲美的频率引入。如上所述，这并不总是可能的。然而，对于涉及几个氨基酸突变的实验，我们预计突变蛋白的表达水平不会显著改变。 合成和购买HDR的线性单链修复模板，作为4 nmol超薄寡头。 将嗜热寡核苷酸修复模板重新存放在无核酸酶水中，使维修模板的库存为 1 μg/μL，并将其存储在 -30 °C，直至进一步使用。 3. 筛选入门设计 使用 CLC 序列查看器或其他类似应用程序，分别在编辑的两侧设计 20 到 23 个底座对向前和反向底漆，以便在 PCR 放大时产生 400 到 600 个碱基对的波段。 对于大小为数千基的较大插入，设计前引物位于维修模板左侧同源臂外。设计位于维修模板本身内的反向引脚。在这种情况下，PCR 产品仅在积极编辑的蠕虫的情况下获得。 要识别用于更长插入的同源编辑蠕虫，则通过设计位于插入路口外的前进和反向引物来放大插入的整个区域。 在使用引数进行基因分型之前，使用野生型基因组DNA测试引线并优化 PCR 条件。 确保在 PCR 放大基因组 DNA 时（如果适用）时产生单个预期尺寸的波段。 4. 准备年轻的成年蠕虫注射 将 L2-L3 阶段 C. elegans 选到 MYOB 板上的新鲜细菌草坪上，并在 20 °C 的夜间孵育。注：制作 MYOB 板的协议可在此处找到：http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ 在微注射当天，挑选子宫内胚胎少于10个的年轻成年蠕虫进行注射。 5. 准备注射混合物 按照无菌无核酸性管中表 1 中显示的相同顺序准备注射混合物。注：如果预计未来使用此混合物的注射，可以缩小注射组合的组件，以制作 5 μL 注射混合物（而不是 20 μL）。 通过管道混合注射混合。 在 37 °C 下孵育注射混合物 15 分钟，以组装核糖核蛋白复合物。 在 4 °C 下旋转注射混合物，在 17，000 x g 下旋转 5 分钟。 6. 微射入 C. 埃莱根斯 妖干 执行CRISPR注射混合到 C.埃莱甘斯 戈纳德的微注射，如在Iyer等人2019年43描述。 注射约30蠕虫与CRISPR注射混合。未使用的注射混合物可在4°C下储存约6个月，而不会损失效率49。 如果可能的话，注射两个淋瑙手臂。注射蠕虫被认为是P0 代。 7. 注射蠕虫恢复和转移 微注射后，使用蠕虫采摘将微注射的P0 蠕虫移到60毫米MYOB Agar板上，并播种OP50 大肠杆菌 ，让它们在室温下恢复约一小时。 请注意，恢复温度将取决于注射蠕虫的基因型。例如，对于对温度敏感的菌株，可能需要在不同温度下恢复蠕虫。 使用铂线蠕虫采摘，将每个注射蠕虫转移到一个单一的种子35毫米MYOB阿加培养皿板，并允许他们在20°C下产卵，直到第二天。 请注意，一些蠕虫会因微注射程序的伤害而死亡。只挑选那些活着的蠕虫，并表现出运动。 24 小时后，将注射的蠕虫转移到新的单个板（每板 1 只蠕虫）。 8. 挑选 C.用于筛查的优雅 注射后20°C的3至4天，使用解剖显微镜监测所有含有注射蠕虫后代的板。 识别具有 F1 后代展示滚筒 （Rol） 和垃圾 （Dpy） 表型的板。Dpy 表型是蠕虫在同一发育阶段（蠕虫基础：https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10）出现比控制蠕虫更短、更笨重的地方。带有罗尔蠕虫和 Dpy 蠕虫的板代表 F1 后代已成功编辑的板， 其 dpy-10 （cn64） 突变将分别存在于其异质或同源状态中。 挑选最滚筒和垃圾蠕虫的盘子进行筛选。 从这些盘子中挑出 50 到100 个 F 1 Rol 蠕虫到它们自己的单独盘子（每盘 1 只蠕虫），并允许它们产卵。 允许L4级F1 罗尔蠕虫产卵并产生后代（F2）1至2天。 9. 单蠕虫裂解和PCR 生产F2 1至2天后，将每个单体F1 Rol母体转移到2.5微升裂解缓冲器 （表2）， 稀释1：100 20毫克/mL蛋白酶K。 将管子在 -30 °C 下冻结 20 分钟。蠕虫可以在此阶段长期存储，直到进一步分析。 在 PCR 热循环器上执行单蠕虫裂解，具有以下条件：1 小时 60 °C，15 分钟 95 °C，保持在 4 °C。 将以下试剂直接添加到含有 PCR 管的裂解蠕虫的 2.5 μL 中：12.5 μL 的 2 倍 PCR 混合物，其中含有 dNTP， DNA 聚合酶、MgCl2 和加载染料、1 μL 的 10 μM 前引物、1 μL 的 10 μM 反向引物以及无菌水至 22.5 μL。每个 PCR 反应的总体积为 25 μL。注：在筛选多个F1 蠕虫的情况下，制作多反应PCR主混合物，并在每个裂解管中加入22.5微升的主混合物，是更快、更方便的。 在热循环器上设置 PCR 反应，条件如下：1 分钟 95 °C，15 秒 95 °C 的 35 周期，15 秒的 55 °C（优化为每个引物集），72 °C 1 分钟（优化每个目标 DNA）44。将反应保持在 4 °C。 10. 限制消化和藻胶电泳 注：限制消化仅在筛选小编辑（小于 50 bp）时才需要。 将 PCR DNA 的 10 μL 从第 9 步转移到新管子中。 每 15 μL 反应添加 2 到 4 个单位的限制酶和 1 倍限制酶缓冲器（1.5 μL 的 10 倍反应缓冲器）。 在 37 °C（或其他酶特异性温度下）孵育 2 小时（快速作用酶的潜伏时间可能更短）。 加热在 65 °C（或其他酶特异性温度）加热 PCR 管 10 到 15 分钟，从而使限制消化失活。 将每个 PCR 管的整个反应加载到 1%-2% 的玫瑰凝胶的单井中，并在 110 mA 下运行凝胶，直到实现适当的带分离。注：我们使用 PCR 混合物，该混合物中已包含一种加载染料，用于可视化，同时在阿加罗斯凝胶上运行。这种组合不干扰限制消化反应，因此方便用于一次筛选许多蠕虫。 11. 识别积极编辑的蠕虫 可视化紫外光下的玫瑰凝胶（用于溴化物凝胶），以检测DNA带大小。注：由于使用在蠕虫基因组中所需地点携带限制位点的修复模板进行编辑，积极编辑的蠕虫将以预期大小显示额外的DNA带。F1 滚筒蠕虫预计将是异质的编辑，因此预计将显示三个频段（一个野生类型的未切割 PCR 产品和两个较小的片段从编辑切割 PCR 产品）。虽然很少见，但必须指出，同源性确实偶尔出现。 保存所有原始积极编辑的板，直到桑格测序验证编辑的存在。 12. 感兴趣的同性恋编辑 从各自积极编辑的F 1 Rol蠕虫板中挑选8至12种看起来不滚动的F2蠕虫，并允许它们产卵并产生1至2天的后代。注：由于 C.elegans 正在自我受精，如果经过编辑的等位基因不影响生存能力或发育，预期同源突变体的比例应约为25%。非滚动F2 蠕虫必须是野生类型的 dpy-10 蝗虫。挑选非滚动蠕虫使编辑蠕虫的生成失去了 dpy-10（cn64） 突变，只有突变在你的感兴趣的基因。 请注意 ，dpy-10 基因存在于第二染色体上。如果你感兴趣的基因与 dpy-10有关，你可能无法轻易地将 dpy-10 突变从你感兴趣的基因中分离出去。 执行步骤 9 到 11 来识别同源蠕虫线。 13. 通过排序确认编辑 一旦同源蠕虫被识别，执行裂解和PCR如第9步所述。 设置至少 3 个 PCR 反应，用于对每个同源线进行排序。 使用 PCR 净化套件净化 PCR 反应。 使用纳米滴光谱仪测量DNA浓度。 发送带有桑格测序的相应前引子的示例。确保前引向设计为至少 50 个基地，远离要排序的编辑。 使用序列分析软件分析测序结果，以确认编辑的存在。

Representative Results

rbm – 3 . 2是一种假定 RNA 结合蛋白，具有与人类刺激因子子子 2 tau 变体（蠕虫基础： https : / / wormbase . org / species / c _ elegans / gene / WBGene00011156 # 0 – 9fcb6d – 10 ）的同源性。RBM-3.2蛋白被确定为蛋白质磷酸酶1（GSP-1）及其调节剂抑制剂-2（I-2SZY-2）和SDS-22的结合伙伴，在先前的一项研究中，这些蛋白质被确定为C.elegans百分比重复（数据未显示）45的新调节剂。目前，关于c.elegans中rbm-3.2基因的功能知之甚少。因此，为了进一步研究C.elegans rbm-3.2基因的生物学作用，从卡诺哈布迪炎遗传学中心（CGC）获得了rbm-3.2-空等位基因rbm-3.2（ok688）。 不幸的是，除了拥有整个 rbm-3.2 基因的删除 ，rbm-3.2 （ok688） 等位基因还会导致部分删除重叠的基因 rbm-3.1， 从而使基因分析复杂化。因此，为了准确研究 rbm-3.2 基因在 C.elegans 中的作用，我们使用CRISPR/Cas9编辑引入了三个过早停止科顿非常接近 C.elegans rbm-3.2 编码区域的开始，使重叠 的rbm-3.1 基因完好无损。 为了将这些过早停止的科顿引入C.elegans rbm-3.2基因，我们设计了一个具有PAM图案的crRNA，该图案位于DNA（图1A）的对立链（模板链）上。Cas9 切割站点位于距离rbm – 3.2启动科顿 ATG 6 个基地之外。将过早停止的科顿引入rbm-3.2基因， 我们设计了一个维修模板，具有以下五个主要特点： 1） 35 基地不间断的同源到rbm – 3.2上游的 rbm – 3.2开始科顿 （左同源臂） 2 ） 包含 PAM 图案的短段基座被删除 3） 启动后立即引入 EcoRI 限制站点以进行筛选 4） rbm-3.2的第二个和第三个 codon 被删除， 在第五次RBM-3.2 codon停止将rbm-3.2 mRNA 5）35个不间断同源基座翻译为rbm-3.2的第一个内联体被纳入编辑的下游（右同源臂）（图1B）之后，引入了三个停止同源体。 此 CRISPR 实验的注射组合已按照表一中所示准备。注射混合物在37°C下孵育15分钟，以组装核糖核蛋白复合物。然后，该混合物被离心并装入拉的微喷射针中。微射到C.埃莱根的妖一郎执行如在Iyer等人描述2019年43。 图2描绘了使用此协议生成经过编辑 的 C. elegans 的 实验时间表。虽然我们通常为每个CRISPR实验注射30种蠕虫，但有些实验室为每个CRISPR实验注射的蠕虫较少（在10到20之间）。由于注射更多的蠕虫会增加找到正编辑的可能性，我们更喜欢注射更多的蠕虫。许多实验室选择”大奖”育雏（超过50%的罗尔和Dpy后代的板）进行筛选。根据我们的经验，在进行了几次CRISPR实验后，虽然头奖育雏偶尔会出现，但大多数时候，被挑选用于筛选的罗尔蠕虫通常来自许多不同的P0 板，每个板都由几个Rol后代组成。在这个实验中，没有获得头奖育雏。 我们总共筛选了73个F1罗尔蠕虫的基因组DNA，这些蠕虫是从7个注射的P0蠕虫中获取的，用于编辑的存在。筛选引物的序列及其位置与rbm-3.2基因的启动科顿在图3A中表示。通过我们的分析，73个F1蠕虫中有7个被发现对编辑呈阳性（9.5%）（图3B）。未经编辑的蠕虫在EcoRI消化后显示单个DNA片段为445个基点。然而，在rbm-3.2基因中携带过早停止的蠕虫在EcoRI消化后分别表现出两个265个基点和166个基点的片段。经异质虫编辑的蠕虫在EceRI消化后显示三个片段：一个野生型未经编辑的DNA片段，分别为445个基点和两个DNA片段，分别为265个基点和166个基点，分别来自rbm-3.2基因的编辑副本。 为了识别携带同源编辑的蠕虫，我们从已识别的正F1异质虫转移到新的单个板上，并允许它们产生后代（F3）。然后，F2蠕虫被筛选出如前所述的同源性。在12种（50%）筛选的蠕虫中，有6种被发现为同源蠕虫，供我们编辑感兴趣（图4A）。鉴定的同源虫系的基因组DNA用于建立DNA测序反应。DNA测序分析证实编辑在其同源状态（图4B）的存在。一般来说，它有利于序列多个同源蠕虫线，以确保所有同源性编辑的蠕虫线表现出相同的表型（如果空突变产生特定表型）。此外，可能还需要使用基于表达的检测（如西式印迹或 RT-PCR）或通过表型分析验证基因敲除。这是因为，尽管在基因的开端引入了早停止同位素，但早停止同位素的下游可能存在另一种ATG。这种ATG可用于启动蛋白质表达，导致部分功能截断的蛋白质。 试剂 浓度 要添加的音量 无核酸酶水中的Cas9蛋白，含20%甘油 2 微克/微升 5 微升 5 m 特里斯 – 克 ph 7.5 中的特拉克纳 4 微克/μL 5 微升 dpy- 10 crrna 在 5 m 特里斯 – Cl ph 7.5 8 微克/μL 0.4 微升 rbm-3.2 crrna 在 5 mm 特里斯 – Cl ph 7.5 8 微克/μL 1 微升 dpy-10 无菌无核素水中的修复模板 500 ng/μL 0.55 微升 rbm-3.2 无菌无核素水中的修复模板 1 微克/μL 2.2 微升 无菌无核酸水中的 Kcl 1 M 0.5 微升 无菌无核酸酶水 – 5.35 微升 表1：使用核糖核蛋白复合物和dpy-10作为共CRISPR标记的CRISPR/Cas9编辑注射混合物的组件。使用无菌技术和无RSAse试剂，同时使注射混合。请注意，无菌、非 DEPC 处理的无核酸酶水用于混合注射。 试剂 浓度 要添加的音量 氯化钾 1 M 5 mL 特里斯 – 赫克 ph 8.3 1 M 1 mL MgCl2 1 M 250 微升 NP-40 （或伊格帕尔 CA-630） 100% 450 μL 特温-20 100% 450 μL 明胶 2% 500 μL 水 – 92.35 mL 表2：蠕虫裂解缓冲配方。 蠕虫裂解缓冲器可以批量、自动冷冻、过滤和筛选，以便长期储存（注：裂解缓冲器可在室温下储存一年以上）。每次使用前在蠕虫裂解缓冲器中加入 1：100 稀释 20 毫克/mL 蛋白酶 K。 图1：示意图显示 crRNA 和修复模板设计为 rbm-3.2 过早停止 CRISPR。A. 示意图显示rbm-3.2基因的编码和模板链，以及位于模板链上的 crRNA 序列和 PAM 图案序列。B.示意图表示合成的修复模板的不同特征，将三个过早停止的科顿引入rbm-3.2基因。请单击此处查看此图的较大版本。 图2：使用预组装的核糖核蛋白复合物和dpy-10作为共同CRISPR标记，通过CRISPR/Cas9编辑生成同源编辑的C.elegans的实验时间表。使用这种 CRISPR/Cas9 编辑方法生成同源编辑的C. elegans所需的步骤的日常细目。简言之，30只蠕虫被注射到CRISPR编辑组合使用微注射和隔离到个别MYOB板种子OP50大肠杆菌。24小时后，注射的P0蠕虫被转移到新鲜的MYOB板上，并被允许继续产卵。在微喷射后的第3天和第4天，对板块进行了ROL F1蠕虫的存在检查。选择最大数量的 Rol 和 Dpy F1蠕虫的板，并选择 73 个 F1 Rol 蠕虫（我们通常每个 CRISPR 实验选择 50 到100个 F 1 Rol 蠕虫）被单挑到新的单个 MYOB 板（每板 1 个蠕虫），并允许产卵约 2 天。在微注射后的第6天，蠕虫解质是从产生后代（F2）的F1蠕虫中制备的，并经PCR筛选出是否有编辑，然后用EcoRI和阿加罗斯凝胶电泳进行限制消化。第7天，12个非罗尔，非DpyF2蠕虫从正板转移到新的单个板，并允许产生后代（F3）。在第 9 天，F2蠕虫被筛选为编辑的同质性，如前所述。第10天，对同源F3蠕虫进行了蠕虫裂解、PCR和PCR清理，并使用纳米滴光谱仪测量DNA浓度。第11天，桑格测序反应被设置为阳性样本，反应被送往DNA测序。在第 12 天，对测序结果进行了分析，并使用序列分析软件（例如 CLC 序列查看器）验证了编辑的存在。请单击此处查看此图的较大版本。 图3：对异质性对rbm-3.2过早停止科顿的C.elegans进行筛查。阿加罗斯凝胶电泳图像的C.埃莱甘斯基因组PCRDNA消化与EcoRI。73 个单独的 F1蠕虫被基因化和筛选的rbm-3.2编辑的存在。红色数字和星号表示积极编辑的蠕虫。所有7个经过积极编辑的C.elegans都是异质的，因为它们在EceRI消化后，分别从rbm-3.2基因的编辑副本中展示了一个445个基点的野生型未经编辑的DNA片段和两个265个基点和166个基点的DNA片段。请单击此处查看此图的较大版本。 图4：识别和验证携带rbm-3.2的同源编辑的C.elegans过早停止科顿。A.筛查C. elegans是同源的rbm – 3.2过早停止科顿。阿加罗斯凝胶电泳图像的C.埃莱甘斯基因组DNA消化与EcoRI。来自正板的12个单独的 F 2 蠕虫被基因型化， 并筛选出rbm – 3.2编辑的同质性。红色：同源编辑的蠕虫。在 12 种筛选的 F2蠕虫中， 有 6 种 （50%） 是rbm – 3.2过早停止科顿的同源体。蠕虫 7 没有 PCR 产品。B.通过DNA测序确认在rbm-3.2中插入过早停止的科顿。示意图显示未经编辑和编辑的同源体的DNA和蛋白质序列的比较。对同源虫的基因组DNA测序结果的分析证实，在CRISPR/Cas9编辑后，rbm-3.2基因中存在三个过早停止的科顿。CRISPR/Cas9 编辑后产生的所有氨基酸变化均以红色字母或红色星号表示。请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

除了 rbm-3.2 之外，我们还使用上述协议编辑了几个基因。我们针对不同 loci、指南 RNA 和修复模板（单链和双链）的编辑效率在 2% 到 58% 之间（未显示数据）。所观察到的编辑效率可与^本协议27 之前报告的编辑效率 2% 至 70% 相媲美。我们还成功地利用这种技术进行基因缺失。使用两个 crRNA，我们用绿色荧光蛋白 （GFP） 的编码序列（未显示数据）替换了长度接近 6 kb 的基因。对于这个实验，大约14%的Rol F₁ 蠕虫被分析发现对基因删除和GFP的替代是积极的（数据没有显示）。但是，还需要进行额外的实验，以确定使用此技术可以执行的基因缺失和替换的最大长度。

这种技术可用于使插入约1.6千瓦的长度^19。最近的一项研究表明，使用此协议进行长度超过 1.6 kb 的插入，生成两个双链断裂，并使用具有较长同源臂的修复模板，可以插入更大的 DNA 片段 （+10 Kb）^28。或者，可以执行此协议的多轮基因编辑以生成更大的编辑。其他基于质粒的C.elegansCRISPR/Cas9基因编辑协议也可以用于CRISPR实验，涉及插入大于1.6kb^46，47，48的DNA片段。

在使用此协议进行基因编辑之前，必须确保感兴趣的基因与染色体 II 上的dpy-10位点无关。如果目标基因与dpy-10相关联，将dpy-10突变从您的兴趣编辑中分离出去可能会有问题。因此，如果感兴趣的基因与dpy-10位点有关， 其他共同CRISPR标记，如unc-58 （X染色体），unc-22或禅-4 （染色体IV），和ben-1或pha-1 （染色体 III） 位于不同的染色体上， 可以使用^{24，25，26，28}. 。来自迈耶实验室的数据表明，本-1和Zen-4突变可以用作成功的共同CRISPR标记，用这种方法²⁸进行筛选。然而，重要的是要注意，使用禅-4和pha-1作为共同CRISPR标记，需要分别在非野生型禅-4（cle10ts）或pha-1（e2123ts）背景中分别进行CRISPR实验26、28。此外，CRISPR实验涉及一些共同CRISPR标记，如ben-1可能需要准备特殊的板（如含有苯二甲酰基苯甲酸乙酰^）28。我们已成功使用unc-58共 CRISPR 标记屏蔽使用此方法与dpy-10关联的基因的正向编辑（未显示数据）。unc-58（e665）突变赋予了可见表型（瘫痪），可以有效地用于筛选积极编辑的蠕虫^24。或者，如果可以使用荧光显微镜，荧光标记的gtbp-1基因也可以用作此协议¹⁹的共同CRISPR标记。

为了在使用这种基因组编辑方法时获得高编辑效率，编辑站点必须在 Cas9 切割站点的 10 到 30 个碱基内。如果编辑站点距离 Cas9 切割站点超过 30 个基数，则编辑效率将大幅下降 19、35、37。然而，迈耶实验室最近的一项研究表明，利用此协议²⁸在彼此距离处创建两个双链断层可以插入远离 Cas9 切割站点的编辑。

在当前协议中，修复模板被设计为使所有三个插入的停止 codon 都显示在同一读取帧中。然而，另一种策略，创造空突变体将是使用通用的43基地长敲击STOP-IN盒式磁带，已经描述了以前^50。重要的是，这盒盒式磁带在所有三种可能的阅读帧中都停止了 codons，并导致帧移位突变。当编辑站点发生不当或不完整的修复时，这是生成空突变体的特别有用的策略。

总之，由于其持续时间短和最近这一方法的进步，这是一个很好的方法，为常规实验室实验涉及添加短免疫性表同体标签，荧光标签，使基因删除，基因替代和科顿替代。

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Premixed	N/A
Cas9 protein	PNA Bio	CP01	Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	N/A	Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI	New England Biolabs	R3101S	Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit	Qiagen	28004	Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix	Meridian Bioscience	BIO-25043	Stored at -30 °C
Primers	IDT	N/A	Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K	Gold Bio	P-480-SL4	Stored at -30 °C
Repair template oligos	IDT	N/A	4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	U-002005-50	Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C