CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Published: December 11, 2020

doi:

10.3791/62001

Amy Smith, Mary Bergwell*¹, Ellie Smith*¹, Danita Mathew*¹, Jyoti Iyer

¹Department of Chemistry and Biochemistry,The University of Tulsa

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

Abstract

Das bakterielle Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-assoziierte Protein (Cas) System wurde von Forschern genutzt, um wichtige biologisch relevante Probleme zu untersuchen. Die beispiellose Leistungsfähigkeit der CRISPR/Cas-Genom-Editing-Methode ermöglicht es Forschern, jeden Ort ihrer Wahl präzise zu bearbeiten und so ein besseres Verständnis der Genfunktion zu ermöglichen. Mehrere Methoden zur Bearbeitung des C. elegans-Genoms mittels CRISPR/Cas9 wurden bereits beschrieben. Hier diskutieren und demonstrieren wir eine Methode, die in vitro zusammengesetzte Ribonukleoproteinkomplexe und den dpy-10 co-CRISPR-Marker für das Screening verwendet. Insbesondere gehen wir in diesem Artikel schritt für Schritt durch den Prozess der Einführung vorzeitiger Stoppcodons in das C. elegans rbm-3.2-Gen durch homologiegerichtete Reparatur mit dieser Methode der CRISPR / Cas9-Bearbeitung. Diese relativ einfache Bearbeitungsmethode kann verwendet werden, um die Funktion jedes interessierenden Gens zu untersuchen und ermöglicht die Generierung von homozygoten C. elegans durch CRISPR / Cas9-Bearbeitung in weniger als zwei Wochen.

Introduction

Die Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) Technologie ermöglicht eine effiziente gezielte Genom-Editierung in einer Vielzahl von Organismen¹^,²^,³^,⁴. Das CRISPR-System wurde zuerst als Teil einer prokaryotischen antiviralen Immunantwort entdeckt⁵^,⁶^,⁷. Das Typ-II-CRISPR-System verwendet eine Endonuklease wie Cas9, eine transaktivierende RNA (tracrRNA) und eine kurze, Ziel-DNA-spezifische 20-Nukleotid-Langführer-CRISPR-RNA (crRNA), um ein “NGG” Protospacer Adjacent Motif (PAM) zu erkennen und einen doppelsträngigen Bruch in der Ziel-DNA⁵^,⁶^,⁷^,⁸, 9^,¹⁰,¹¹^,¹²zu machen . Dieser doppelsträngige Bruch wird von der zellulären DNA-Reparaturmaschinerie als Läsion erkannt. Folglich kann der erzeugte Doppellitzenbruch durch einen von zwei Wegen repariert werden- i) Nicht-homologe Endfüge (NHEJ) oder ii) Homologie-gerichtete Reparatur (HDR)¹³. NHEJ ist oft fehleranfällig und wenn dieser Weg verwendet wird, um den doppelsträngigen Bruch in der Ziel-DNA zu reparieren, verursacht es oft inaktivierende Mutationen (Insertionen, Deletionen) im interessierenden Gen. Auf der anderen Seite, indem eine exogene Reparaturschablone mit Homologie auf beiden Seiten des Doppelstrangbruchs geliefert wird, kann die zelluläre DNA-Reparaturmaschinerie angewiesen werden, HDR zu verwenden, um den Bruch zu reparieren¹³. Die HDR-Methode ermöglicht somit eine präzise Bearbeitung jedes interessierende Ortes.

Eine Vielzahl von CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Protokollen wurde für C. elegans¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰beschrieben. Die am häufigsten verwendeten CRISPR/Cas9-Bearbeitungsmethoden in C. elegans umfassen sowohl klonbasierte als auch klonfreie Protokolle, um Reparaturvorlagen für die CRISPR/Cas9-Bearbeitung¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰zu generieren . Dieses Protokoll diskutiert ausführlich ein klonfreies CRISPR/Cas9-Bearbeitungsprotokoll, das auf der Verwendung von dpy-10 als Co-CRISPR-Marker für das Screening basiert. Bisher verwendet das einzige detaillierte C. elegans-fokussierteCRISPR/Cas9-Bearbeitungsvideoprotokoll, das es gibt, einen fluoreszierenden Marker für das Screening²¹. Die Verwendung eines fluoreszierenden Markers für das Screening erfordert jedoch den Zugang zu einem Fluoreszenzmikroskop, das für viele Labore an kleinen Primary Undergraduate Institutions (PUIs) schwer zugänglich ist. Es ist ermutigend festzustellen, dass in früheren Studien positive korrelative Ergebnisse zwischen Würmern, die fluoreszierende Marker tragen, und dem Vorhandensein des Edit²¹^,²²erzielt wurden. Es sind jedoch zusätzliche Studien erforderlich, um die Gesamteffizienz der fluoreszenzbasierten Screening-Methode zur Bearbeitung einer Vielzahl von Loci mit verschiedenen Führungs-RNAs und Reparaturvorlagen zu bestimmen. Da die Plasmide, die für diese fluoreszierenden Marker kodieren, extrachromosomale Arrays bilden, wird aus diesen Arrays oft eine variable Fluoreszenz erzeugt, die die Identifizierung von Positiven erschweren kann²³. Obwohl die fluoreszenzbasierte Screening-Methode nützlich sein kann, können die oben genannten Probleme ihre Anwendbarkeit einschränken.

Die Verwendung eines Co-CRISPR-Markers, der einen sichtbaren Phänotyp erzeugt, reduziert die Anzahl der Nachkommen, die gescreent werden müssen, um einen positiv bearbeiteten Wurm zu^{finden, erheblich 23}^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸. Wichtig ist, dass die Phänotypen, die von diesen Markern erzeugt werden, leicht unter einem einfachen Seziermikroskop²³^,24 ,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹,³⁰^,³¹^,32^,³³^,³⁴nachgewiesen werden können. Der dpy-10 co-CRISPR Marker ist einer der am besten charakterisierten und weit verbreiteten co-CRISPR Marker für die Durchführung von C. elegans CRISPR/Cas9 Genom Editing²⁴^,²⁷. Daher wird in diesem Artikel die Methode zur Durchführung der CRISPR/Cas9-Bearbeitung bei C. elegans unter Verwendung der direkten Abgabe von Ribonukleoproteinkomplexen mit dpy-10 als Co-CRISPR-Marker²⁷^,³⁵diskutiert. Bei diesem Verfahren besteht die vorbereitete Editier-Injektionsmischung aus einer gut charakterisierten dpy-10 crRNA und dpy-10 Reparaturvorlage, um die Erzeugung eines beobachtbaren dominanten “Roller” (Rol) Phänotyps zu vermitteln, der durch eine bekannte heterozygote dpy-10(cn64)-Mutation innerhalb des dpy-10-Gens ²⁴^,²⁷^,²⁹verliehen wird. Wenn sie in ihrem homozygoten Zustand vorhanden ist, verursacht die dpy-10 (cn64) -Mutation einen dumpy (Dpy) Phänotyp, der kürzere und kräftigere Würmer produziert²⁴^,²⁹. Der Rol-Phänotyp wird durch das genaue Einfügen der gemeinsam gelieferten dpy-10-Reparaturvorlage in eine einzige Kopie des dpy-10-Gens durch HDR-vermittelte CRISPR/Cas9-Bearbeitung vermittelt. Daher deutet das Auftreten von Rol C. elegans auf eine erfolgreiche Injektion sowie ein erfolgreiches HDR-vermitteltes Bearbeitungsereignis in den Zellen des injizierten Wurms hin. Da sich die crRNA und die Reparaturvorlage des interessierenden Zielgens im selben Injektionsmix mit der Reparaturvorlage dpy-10 crRNA und dpy-10 befinden, besteht eine gute Chance, dass die identifizierten Rol-Würmer gleichzeitig am interessierenden Zielgen editiert wurden. Daher werden diese Rol-Würmer dann durch Techniken wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (für Bearbeitungen größer als 50 bp) oder durch PCR gefolgt von Restriktionsverdauung (für Bearbeitungen unter 50 bp) auf die Bearbeitung von Interesse untersucht.

Die Vorteile der Verwendung dieser Methode für die Genom-Editierung sind: i) CRISPR-Edits können mit dieser Methode mit einer relativ hohen Effizienz (2% bis 70%) generiert werden²⁷; ii) die Reparaturvorlagen und Leit-RNAs, die bei dieser Methode verwendet werden, beinhalten kein Klonen, wodurch die für ihre Generierung erforderliche Zeit verkürzt wird; iii) durch die Assemblierung von Ribonukleoproteinkomplexen in vitrokönnen die Konzentrationen der zusammengesetzten Editierkomplexe relativ konstant gehalten werden, wodurch die Reproduzierbarkeit verbessert wird; iv) einige Leit-RNAs, die keine Bearbeitungen erzeugen, wenn sie aus Plasmiden exprimiert werden, haben sich als CRISPR/Cas9-Genom-Editing erwiesen, wenn sie als in vitro transkribierte crRNAs²⁷geliefert werden; v) einschließlich des dpy-10 co-CRISPR-Markers ermöglicht ein einfaches Screening mit einem Seziermikroskop und verringert die Anzahl der Nachkommen, die gescreent werden müssen, um Positive zu finden²⁴^,²⁷; und vi) DNA-Sequenzierung verifiziert homozygote editierte Wurmlinien können mit dieser Methode innerhalb weniger Wochen erhalten werden¹⁹^,²⁷.

Ausgezeichnete Buchkapitel zu vielen verschiedenen C. elegans CRISPR-Methoden wurden^{veröffentlicht 14}^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁴³. Allerdings fehlt derzeit die Demonstration der dpy-10 co-CRISPR-Methode im Videoformat im Labor. In diesem Artikel beschreiben und demonstrieren wir den Prozess der Verwendung der dpy-10 co-CRISPR-Methode zur Bearbeitung eines repräsentativen Zielgens namens rbm-3.2, einem mutmaßlichen RNA-bindenden Protein (WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Konkret beschreiben wir hier detailliert die Methode der Einführung von drei vorzeitigen Stoppcodons innerhalb des C. elegans rbm-3.2 Gens unter Verwendung von in vitro assemblierten Ribonukleoproteinkomplexen und einer exogen versorgten linearen einzelsträngigen Reparaturschablone. Diese Studien waren erfolgreich bei der Erzeugung des ersten C. elegans CRISPR-Stammes mit vorzeitigen Stoppcotonen im rbm-3.2-Gen. Da derzeit nicht viel über die Funktion dieses Gens bei C. elegans bekannt ist, wird dieser Stamm als nützliches Werkzeug bei der Sezierung der Funktion von RMB-3.2 dienen. Diese Methode kann auch eingesetzt werden, um Insertionen, Substitutionen und Deletionen an jedem Ort innerhalb des C. elegans-Genoms vorzunehmen.

Protocol

Dieses Protokoll für die CRISPR/Cas9-Genombearbeitung wurde vom Institutional Biosafety Committee der University of Tulsa gemäß den NIH-Richtlinien genehmigt. Während dieses Protokolls wurde sterile Technik praktiziert. Alle Schritte dieses Protokolls wurden mit Reagenzien durchgeführt, die frei von Nukleasen waren. Besondere Sorgfalt wurde darauf geachtet, RNase-Kontaminationen wie Reinigungshandschuhe sowie Arbeitsbereiche und Geräte (z. B. Pipetten, Außenseite von Glaswaren usw.) mit einer RNase-Dekontaminationslösung zu verhindern. 1. crRNA-Design Suchen Sie den PAM, mit dem Cas9 am nächsten zur Bearbeitungsseite schneiden kann. Die PAM-Seite ist 5′-NGG-3′. Denken Sie daran, dass sich das PAM auf beiden Strängen der DNA befänglich sein kann. Wählen Sie 20 bp am 5′-Ende des PAM als crRNA-Sequenz.HINWEIS: Die tatsächliche crRNA-Sequenz, die von kommerziellen Unternehmen synthetisiert wird, ist länger als 20 bp, da sie eine zusätzliche generische Sequenz aufwies, die automatisch der zielspezifischen 20 bp crRNA-Sequenz vom synthetisierenden Unternehmen hinzugefügt wird. In Bezug auf Off-Target-Effekte haben neuere Studien keine Off-Target-Effekte von Cas9 bei C. elegans36,37,38,39,40gefunden. Weiterhin werden die resultierenden CRISPR-editierten Stämme durchkreuzt. Daher sind wir nicht sehr besorgt über Off-Target-Effekte der entworfenen crRNAs. Online-Websites, einschließlich http://genome.sfu.ca/crispr/ und http://crispor.tefor.net/, können jedoch verwendet werden, um die crRNAs mit den geringsten Off-Target-Effekten zu finden und auszuwählen38,41. crRNAs, die mit einem G oder GG enden und solche mit mehr als 50% GC-Gehalt werden als effizienter19,23,42vorhergesagt. Bestellen Sie mindestens 10 nmol der crRNA bei einem Unternehmen (z.B. IDT, Horizon Discovery, etc.). Sobald die lyophilisierte crRNA angekommen ist, lagern Sie sie bei -30 ° C bis zum Tag der Mikroinjektion. Am Tag der Mikroinjektion die lyophilisierte crRNA mit maximaler Geschwindigkeit (17.000 x g) für eine Minute drehen und in 5 mM Tris-Cl (pH 7,4) resuspendieren, um einen 8 μg/ μL-Bestand der crRNA zu bilden. Lagern Sie den unbenutzten crRNA-Vorrat gefroren bei -80 °C. 2. Vorlagendesign reparieren Laden Sie eine Sequenzmanipulationssoftware herunter (z. B. CLC-Sequenzbetrachter, APE, Snapgene, Vector NTI usw.). Wir verwenden CLC Sequence Viewer Version 8.0 (Qiagen), da es benutzerfreundlich ist und kostenlos heruntergeladen werden kann. Fügen Sie die Sequenz der zielgerichteten DNA von Interesse in den Sequenzbetrachter ein. Die Ausrichtung der Reparaturvorlage beeinflusst die Bearbeitungseffizienz28. Um eine Reparatursequenz an das 5′-Ende des PAM einzufügen, entwerfen Sie eine einzelsträngige Reparaturvorlage mit DNA-Sequenz aus demselben DNA-Strang, auf dem sich die PAM-Sequenz befindet (Protospacer-Strang)28. Entwerfen Sie zum Einfügen einer Reparatursequenz an das 3′-Ende des PAM eine einzelsträngige Reparaturvorlage mit DNA-Sequenz aus dem DNA-Strang, die nicht die PAM-Sequenz (Abstandsstrang)trägt 28. Wählen Sie 35 Basissequenzpaare mit ununterbrochener Homologie auf beiden Seiten (am 5′- und 3′-Ende) der Bearbeitung aus. Mutieren oder löschen Sie die PAM, um das Schneiden der Reparaturschablone oder der bearbeiteten genomischen DNA durch Cas9 zu verhindern. Wenn eine Mutation des PAM nicht möglich ist, führen Sie mehrere stille Mutationen in der Nähe des 5′-Endes des PAM ein, um das Schneiden der Reparaturschablone oder der bearbeiteten genomischen DNA zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass Sie nur stille Mutationen des PAM einführen, wenn es in einer exsonischen Region vorhanden ist. Überprüfen Sie die Häufigkeit der Codon-Verwendung, um sicherzustellen, dass das mutierte Codon mit einer Frequenz eingeführt wird, die mit dem ursprünglichen nicht mutierten Codon vergleichbar ist (z. B. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). In einigen Fällen ist es möglicherweise nicht möglich, das mutierte Codon mit einer ähnlichen Häufigkeit wie das unmutierte Codon einzuführen. Für Mutationen einiger Aminosäuren erwarten wir jedoch nicht, dass das Expressionsniveau des mutierten Proteins signifikant verändert wird. Wenn der Edit klein ist (z.B. Mutation einiger Basen), führe eine eindeutige Restriktionsstelle in der Nähe des Edits durch stille Mutagenese ein. Wir verwenden http://heimanlab.com/cut2.html, um Restriktionsstellen zu finden, die durch stille Mutagenese eingeführt werden können. Überprüfen Sie die Häufigkeit der Codon-Verwendung, um sicherzustellen, dass das mutierte Codon mit einer Frequenz eingeführt wird, die mit der des ursprünglichen nicht mutierten Codons vergleichbar ist. Wie oben erwähnt, ist dies nicht immer möglich. Bei Experimenten mit Mutationen einiger Aminosäuren erwarten wir jedoch nicht, dass das Expressionsniveau des mutierten Proteins signifikant verändert wird. Synthetisieren und kaufen Sie lineare einzelsträngige Reparaturvorlagen für HDR als 4 nmol Ultramer-Oligos. Die lyophilisierte Oligonukleotid-Reparaturschablone in nukleasefreiem Wasser resuspendieren, um einen 1 μg/μL-Vorrat der Reparaturschablone herzustellen und bei -30 °C bis zur weiteren Verwendung zu lagern. 3. Siebgrundierung Design Entwerfen Sie mit dem CLC-Sequenzbetrachter oder anderen ähnlichen Anwendungen 20 bis 23 Basenpaar-Vorwärts- und Rückwärtsprimer auf beiden Seiten der Bearbeitung, so dass sie bei PCR-Amplifikation ein Band von 400 bis 600 Basenpaaren erzeugen. Für größere Einfügungen, die mehrere Kilobasen groß sind, entwerfen Sie die vordere Grundierung so, dass sie sich direkt außerhalb des linken Homologiearms der Reparaturvorlage befindet. Entwerfen Sie die umgekehrte Grundierung so, dass sie sich in der Reparaturvorlage selbst befindet. In diesem Fall wird ein PCR-Produkt nur bei positiv bearbeiteten Würmern erhalten. Um homozygote bearbeitete Würmer für längere Insertionen zu identifizieren, verstärken Sie den gesamten Bereich der Insertion, indem Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer entwerfen, die sich außerhalb der Insertionsverbindungen befinden. Testen Sie die Primer und optimieren Sie die PCR-Bedingungen mit wildtypischer genomischer DNA, bevor Sie die Primer für die Genotypisierung verwenden. Stellen Sie sicher, dass bei der PCR-Amplifikation der genomischen DNA (falls zutreffend) ein einzelnes Band der erwarteten Größe erzeugt wird. 4. Vorbereitung junger erwachsener Würmer für die Injektion L2-L3 Stadium C. elegans auf einem frischen Bakterienwiese auf einer MYOB-Platte pflücken und über Nacht bei 20 °C inkubieren.HINWEIS: Das Protokoll zur Herstellung von MYOB-Platten finden Sie hier: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ Wählen Sie am Tag der Mikroinjektion junge erwachsene Würmer mit weniger als 10 Embryonen in der Gebärmutter, um sie zu injizieren. 5. Vorbereitung der Injektionsmischung Bereiten Sie die Injektionsmischung in der gleichen Reihenfolge wie in Tabelle 1 in sterilen nukleasefreien Röhrchen vor.HINWEIS: Die Komponenten der Injektionsmischung können verkleinert werden, um 5 μL Injektionsmischungen (anstelle von 20 μL) herzustellen, wenn zukünftige Injektionen mit dieser Mischung nicht erwartet werden. Mischen Sie die Injektionsmischung durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Injektionsmischung bei 37 °C für 15 Minuten, um Ribonukleoproteinkomplexe zusammenzusetzen. Die Injektionsmischung bei 4 °C bei 17.000 x g 5 Minuten drehen. 6. Mikroinjektion in die Gonade C. elegans Führen Sie eine Mikroinjektion der CRISPR-Injektionsmischung in die C. elegans-Gonade durch, wie in Iyer et al. 201943beschrieben. Injizieren Sie etwa 30 Würmer mit CRISPR-Injektionsmischung. Die ungenutzte Injektionsmischung kann durch Lagerung bei 4°C für einen Zeitraum von ca. 6 Monaten ohne Effizienzverlust wiederverwendet werden49. Injizieren Sie beide Gonadenarme, wenn möglich. Injizierte Würmer gelten als P0-Generation. 7. Wiederherstellung und Übertragung injizierter Würmer Nach der Mikroinjektion die mikroinjizierenden P0-Würmer mit einem Wurmpickel auf eine 60 mm MYOB-Agarplatte mit OP50 E. coli bringen und bei Raumtemperatur etwa eine Stunde lang erholen lassen. Beachten Sie, dass die Erholungstemperatur vom Genotyp der injizierten Würmer abhängt. Beispielsweise kann bei temperaturempfindlichen Stämmen eine Wurmrückgewinnung bei einer anderen Temperatur erforderlich sein. Mit einem Platindraht-Wurmpickel jeden injizierten Wurm auf eine einzelne ausgesäte 35 mm MYOB-Agar-Petriplatte geben und bis zum nächsten Tag Eier bei 20 °C legenlassen. Beachten Sie, dass einige Würmer infolge einer Verletzung durch das Mikroinjektionsverfahren sterben. Wählen Sie nur die Würmer, die am Leben sind und Bewegung zeigen. Nach 24 Stunden die injizierten Würmer auf neue Einzelplatten übertragen (1 Wurm pro Platte). 8. Kommissionierung C. elegans für das Screening Überwachen Sie 3 bis 4 Tage bei 20 ° C nach der Injektion alle Platten, die die Nachkommen der injizierten Würmer enthalten, mit einem Seziermikroskop. Identifizieren Sie Platten, die F1-Nachkommen haben, die Rollen- (Rol) und Dumpy- (Dpy) Phänotypen aufweisen. Bei einem Dpy-Phänotyp erscheinen Würmer im gleichen Entwicklungsstadium kürzer und kräftiger als Kontrollwürmer (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10). Platten mit Rol- und Dpy-Würmern stellen Platten dar, bei denen dieF1-Nachkommen erfolgreich mit der dpy-10(cn64)-Mutation bearbeitet wurden, um in ihrem heterozygoten bzw. homozygoten Zustand vorhanden zu sein. Wählen Sie die Platten mit den meisten Walzen und dumpy Würmern zum Sieben. Wählen Sie 50 bis 100 F1 Rol Würmer aus diesen Platten auf ihre eigenen einzeln Platten (1 Wurm pro Platte) und lassen Sie sie Eier legen. Lassen Sie L4-gestufte F1 Rol-Würmer Eier legen und Nachkommen (F2)für 1 bis 2 Tage produzieren. 9. Einzelwurmlyse und PCR Nach 1 bis 2 Tagen Herstellung vonF2 wird jede einzelneF1 Rol Mutter in 2,5 μL Lysepuffer (Tabelle 2) mit einer 1:100-Verdünnung von 20 mg/ml Proteinase K überführen. Die Röhrchen bei -30 °C 20 Minuten einfrieren. Die Würmer können in diesem Stadium über einen längeren Zeitraum bis zur weiteren Analyse gelagert werden. Führen Sie eine Einzelwurmlyse an einem PCR-Thermocycler unter folgenden Bedingungen durch: 60 °C für 1 Stunde, 95 °C für 15 Min und Halten bei 4 °C. Die folgenden Reagenzien werden direkt in 2,5 μL des lysierten Wurms mit PCR-Röhrchen gegeben: 12,5 μL 2x PCR-Mischung mit dNTPs, DNA-Polymerase,MgCl2 und Ladefarbstoff, 1 μL 10 μM Vorwärtsprimer, 1 μL 10 μM Reverse Primer und steriles Wasser bis 22,5 μL. Das Gesamtvolumen jeder PCR-Reaktion beträgt 25 μL.HINWEIS: Im Falle des Screenings mehrerer F1-Würmer ist es schneller und bequemer, einen PCR-Master-Mix für mehrere Reaktionen herzustellen und 22,5 μL des Master-Mixes zu jedem Lyseröhrchen hinzuzufügen. Richten Sie PCR-Reaktionen auf einem Thermocycler unter folgenden Bedingungen ein: 95 °C für 1 Minute, 35 Zyklen von 95 °C für 15 s, 55 °C für 15 s (für jeden Primersatz optimieren), 72 °C für 1 Minute (für jede Ziel-DNA optimieren)44. Halten Sie Reaktionen bei 4 °C. 10. Einschränkung der Verdauung und Agarosegelelektrophorese HINWEIS: Eine Restriktionsverdauung ist nur beim Screening auf kleine Bearbeitungen (weniger als 50 bp) erforderlich. Übertragen Sie 10 μL der PCR-DNA von Schritt 9 in eine neue Röhrchen. Fügen Sie zwischen 2 bis 4 Einheiten Restriktionsenzym und 1x Restriktionsenzympuffer (1,5 μL 10x Reaktionspuffer) pro 15 μL-Reaktion hinzu. Bei 37 °C (oder bei einer anderen enzymspezifischen Temperatur) für 2 Stunden inkubieren (kürzere Inkubationszeiten können mit schnell wirkenden Enzymen möglich sein). Hitze inaktiviert den Restriktionsdaument, indem die PCR-Röhrchen bei 65 °C (oder einer anderen enzymspezifischen Temperatur) für 10 bis 15 Minuten erhitzen werden. Laden Sie die gesamte Reaktion von jedem PCR-Röhrchen in eine einzige Vertiefung eines 1% -2% igen Agarosegels und führen Sie das Gel bei 110 mA aus, bis eine ordnungsgemäße Bandtrennung erreicht ist.HINWEIS: Wir verwenden einen PCR-Mix, der bereits einen Ladefarbstoff zur Visualisierung enthält, während er auf einem Agarosegel läuft. Diese Mischung stört die Restriktionsverdauungsreaktion nicht und ist daher bequem für das Screening vieler Würmer gleichzeitig zu verwenden. 11. Identifizieren Sie positiv bearbeitete Würmer Visualisieren Sie Agarosegele unter UV-Licht (für Ethidiumbromidgele), um DNA-Bandgrößen zu erkennen.HINWEIS: Positiv editierte Würmer zeigen ein zusätzliches DNA-Band in der erwarteten Größe an, da die Reparaturvorlage mit der Reparaturvorlage bearbeitet wird, die die Restriktionsstelle am gewünschten Ort im Wurmgenom trägt. Es wird erwartet, dass F1-Walzenwürmer für die Bearbeitung heterozygot sind und daher drei Bänder aufweisen (ein wildtypiges ungeschnittenes PCR-Produkt und zwei kleinere Fragmente aus dem bearbeiteten geschnittenen PCR-Produkt). Obwohl selten, muss beachtet werden, dass Homozygoten gelegentlich auftreten. Speichern Sie alle ursprünglichen positiv bearbeiteten Platten, bis das Vorhandensein der Bearbeitung durch Sanger-Sequenzierung überprüft wird. 12. Homozygose Edit von Interesse Wählen Sie zwischen 8 und 12 wildtypisch aussehende nicht rollende F2-Würmer aus den jeweiligen positiv bearbeiteten F1 Rol-Wurmplatten und lassen Sie sie Eier legen und Nachkommen für 1 bis 2 Tage produzieren.HINWEIS: Da C. elegans selbstbefruchtende Hermaphroditen sind, sollte der Anteil der erwarteten homozygoten Mutanten etwa 25% betragen, wenn das bearbeitete Allel die Lebensfähigkeit oder Entwicklung nicht beeinflusst. Nicht rollende F2-Würmer müssen wildtypisch für den dpy-10-Locus sein. Die Auswahl nicht rollender Würmer ermöglicht die Erzeugung von bearbeiteten Würmern, die die dpy-10(cn64)-Mutation verloren haben und nur die Mutation an Ihrem interessierenden Gen haben. Beachten Sie, dass das dpy-10-Gen auf Chromosom II vorhanden ist. Wenn Ihr interessierenswertes Gen mit dpy-10verknüpft ist, können Sie die dpy-10-Mutation möglicherweise nicht einfach von Ihrem interessierenden Gen trennen. Führen Sie die Schritte 9 bis 11 aus, um homozygote Wurmlinien zu identifizieren. 13. Bestätigen Sie die Bearbeitung durch Sequenzierung Sobald homozygote Würmer identifiziert sind, führen Sie Lyse und PCR wie in Schritt 9 beschrieben durch. Richten Sie mindestens 3 PCR-Reaktionen für jede zu sequenzierte homozygote Linie ein. Reinigen Sie die PCR-Reaktionen mit einem PCR-Reinigungskit. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nanotropfen-Spektralphotometer. Senden Sie die Probe mit dem jeweiligen Forward Primer für die Sanger-Sequenzierung. Stellen Sie sicher, dass der Forward Primer so konzipiert ist, dass er mindestens 50 Basen von der zu sequenzierenden Bearbeitung entfernt ist. Analysieren Sie die Sequenzierungsergebnisse mit einer Sequenzanalysesoftware, um das Vorhandensein der Bearbeitung zu bestätigen.

Representative Results

rbm-3.2 ist ein mutmaßliches RNA-bindendes Protein, das homologie zur menschlichen Spaltungsstimulationsfaktor-Untereinheit 2 Tau-Variante (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10) hat. Das RBM-3.2-Protein wurde als Bindungspartner der Proteinphosphatase 1 (GSP-1) und ihrer Regulatoren Inhibitor-2 (I-2SZY-2)und SDS-22 in einer früheren Studie identifiziert, die diese Proteine als neuartige Regulatoren der C. elegans-Zentriole-Duplikation identifizierte (Daten nicht gezeigt)45. Derzeit ist sehr wenig über die Funktion des rbm-3.2-Gens in C. elegans bekannt. Um die biologische Rolle des C. elegans rbm-3.2-Gens weiter zu untersuchen, wurde das rbm-3.2-Null-Allel rbm-3.2(ok688) vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC)erhalten. Leider besitzt das rbm-3.2(ok688)-Allel nicht nur eine Deletion des gesamten rbm-3.2-Gens, sondern führt auch zu einer teilweisen Deletion eines überlappenden Gens, rbm-3.1, wodurch die genetische Analyse erschwert wird. Um die Rolle des rbm-3.2-Gens in C. elegans genau zu untersuchen, haben wir die CRISPR/Cas9-Editierung verwendet, um drei vorzeitige Stopp-Codons sehr nahe am Beginn der C. elegans rbm-3.2-kodierenden Region einzuführen, wobei das überlappende rbm-3.1-Gen intakt blieb. Um diese vorzeitigen Stoppcodons in das C. elegans rbm-3.2-Gen einzuführen, haben wir eine crRNA mit einem PAM-Motiv entworfen, das sich auf dem gegenüberliegenden Strang (Vorlagenstrang) der DNA befand ( Abbildung1A). Die Cas9-Schnittstelle befand sich 6 Basen vom rbm-3.2 Start-Codon-ATG entfernt. Um vorzeitige Stoppcodons in das rbm-3.2-Gen einzuführen, haben wir eine Reparaturvorlage mit den folgenden fünf Hauptmerkmalen entwickelt: 1) 35 Basen ununterbrochener Homologie zu rbm-3.2 vor dem rbm-3.2-Startcodon (linker Homologiearm) 2) Ein kurzer Abschnitt von Basen, die das PAM-Motiv enthielten, wurde gelöscht 3) Eine EcoRI-Restriktionsstelle wurde unmittelbar nach dem Startcodon für das Screening eingeführt 4) Der zweite und der dritte Codon von rbm-3.2 wurden gelöscht und Drei Stoppcodons wurden eingeführt, nachdem das fünfte RBM-3.2-Codon die Translation der rbm-3.2 mRNA gestoppt hatte 5) 35 Basen der ununterbrochenen Homologie zum ersten Intron von rbm-3.2 wurden nach dem Edit (rechter Homologiearm) eingeschlossen (Abbildung 1B). Die Injektionsmischung für dieses CRISPR-Experiment wurde wie in Tabelle Iangegeben hergestellt. Die Injektionsmischung wurde bei 37 °C für 15 Minuten inkubiert, um Ribonukleoproteinkomplexe zusammenzusetzen. Die Mischung wurde dann zentrifugiert und in die gezogene Mikroinjektionsnadel geladen. Die Mikroinjektion in die Gonade von C. eleganwurde wie in Iyer et al. 201943beschrieben durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die experimentelle Zeitleiste für die Generierung bearbeiteter C. elegans mit diesem Protokoll. Obwohl wir normalerweise 30 Würmer für jedes CRISPR-Experiment injizieren, injizieren einige Labore weniger Würmer (zwischen 10 und 20) für jedes CRISPR-Experiment. Da das Injizieren von mehr Würmern die Wahrscheinlichkeit erhöht, positive Bearbeitungen zu finden, ziehen wir es vor, eine größere Anzahl von Würmern zu injizieren. Viele Labore wählen “Jackpot” -Bruten (Platten mit mehr als 50% Rol und Dpy-Nachkommen) für das Screening aus. Nach unserer Erfahrung nach der Durchführung mehrerer CRISPR-Experimente, obwohl Jackpot-Bruten gelegentlich auftreten, stammen die Rol-Würmer, die für das Screening ausgewählt werden, oft von vielen verschiedenen P0-Platten, die jeweils aus einigen Rol-Nachkommen bestehen. In diesem Experiment wurden keine Jackpot-Bruten erzielt. Insgesamt untersuchten wir die genomische DNA von 73F1 Rol-Würmern, die aus 7 injizierten P0-Würmern gewonnen wurden, auf das Vorhandensein des Edits. Die Sequenzen der Screening-Primer und ihre Standorte in Bezug auf das Start-Codon des rbm-3.2-Gens sind in Abbildung 3Adargestellt. Durch unsere Analyse wurden 7 von 73 F 1-Würmern als positiv für die Bearbeitung befunden (9,5%) (Abbildung 3B). Unbearbeitete Würmer zeigten ein einzelnes DNA-Fragment von 445 bp bei der EcoRI-Verdauung. Während Würmer, die ein vorzeitiges Stopp-Codon im rbm-3.2-Gen trugen, bei der EcoRI-Verdauung zwei Fragmente von 265 bp bzw. 166 bp aufwiesen. Heterozygote editierte Würmer zeigten drei Fragmente bei der EcoRI-Verdauung: ein unbearbeitetes Wildtyp-DNA-Fragment von 445 bp und zwei DNA-Fragmente von 265 bp bzw. 166 bp aus der bearbeiteten Kopie des rbm-3.2-Gens. Um Würmer zu identifizieren, die homozygote Bearbeitungen tragen, haben wir 12 F2-Würmer aus den identifizierten positiven F1-Heterozygoten auf neue Einzelplatten übertragen und ihnen erlaubt, Nachkommen zu produzieren (F3). DieF2-Würmer wurden dann wie zuvor beschrieben auf Homozygotie untersucht. 6 von 12 (50%) gescreenten Würmern wurden für unsere Bearbeitung von Interesse als homozygot befunden (Abbildung 4A). Die genomische DNA einer identifizierten homozygoten Wurmlinie wurde verwendet, um eine DNA-Sequenzierungsreaktion einzurichten. Die DNA-Sequenzierungsanalyse bestätigte das Vorhandensein des Edits in seinem homozygoten Zustand (Abbildung 4B). Im Allgemeinen ist es vorteilhaft, mehrere homozygote Wurmlinien zu sequenzieren, um sicherzustellen, dass alle homozygot bearbeiteten Wurmlinien den gleichen Phänotyp aufweisen (wenn die Nullmutation einen bestimmten Phänotyp erzeugt). Darüber hinaus kann es auch notwendig sein, Gen-Knockouts mit einem expressionsbasierten Assay wie Western Blotting oder RT-PCR oder mittels Phänotypanalyse zu validieren. Dies liegt daran, dass es möglich ist, dass trotz der Einführung vorzeitiger Stoppcotons am Anfang des Gens ein alternatives ATG nach den vorzeitigen Stoppcodons vorhanden sein könnte. Dieses ATG könnte verwendet werden, um die Proteinexpression zu initiieren, was zu einem teilweise funktionellen abgeschnittenen Protein führt. Reagenz Konzentration Hinzuzufügenes Volume Cas9-Protein in nukleasefreiem Wasser mit 20% Glycerin 2 μg/μL 5 μL tracrRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5 4 μg/μL 5 μL dpy-10 crRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 0,4 μL rbm-3,2 crRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 1 μL dpy-10 Reparaturschablone in sterilem nukleasefreiem Wasser 500 ng/μL 0,55 μL rbm-3.2 Reparaturschablone in sterilem nukleasefreiem Wasser 1 μg/μL 2,2 μL KCl in sterilem nukleasefreiem Wasser 1 M 0,5 μL steriles nukleasefreies Wasser – 5,35 μL Tabelle 1: Komponenten der Injektionsmischung für die CRISPR/Cas9-Bearbeitung unter Verwendung von Ribonukleoproteinkomplexen und dpy-10 als Co-CRISPR-Marker. Verwenden Sie sterile Techniken und RNase-freie Reagenzien, während Sie die Injektionsmischung herstellen. Bitte beachten Sie, dass steriles, nicht DEPC-behandeltes nukleasefreies Wasser zur Herstellung der Injektionsmischung verwendet wurde. Reagenz Konzentration Hinzuzufügenes Volume Kcl 1 M 5 ml Tris-HCl pH 8,3 1 M 1 ml MgCl2 1 M 250 μL NP-40 (oder IGEPAL CA-630) 100% 450 μL Tween-20 100% 450 μL Gelatine 2% 500 μL Wasser – 92,35 ml Tabelle 2: Rezept für Wurmlysepuffer. Der Wurmlysepuffer kann in loser Schüttung hergestellt, autoklaviert, gefiltert und für die Langzeitlagerung aliquotiert werden (HINWEIS: Der Lysepuffer kann über ein Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden). Fügen Sie dem Wurmlysepuffer kurz vor jedem Gebrauch eine 1:100-Verdünnung von 20 mg / ml Proteinase K hinzu. Abbildung 1: Schematische Darstellung des crRNA- und Reparaturvorlagendesigns für rbm-3.2 vorzeitigen Stopp CRISPR. A. Schematisch, das die Kodierungs- und Vorlagenstränge des rbm-3.2-Gens mit der crRNA-Sequenz und der PAM-Motivsequenz auf dem Vorlagenstrang anzeigt. B. Schematisch, das die verschiedenen Eigenschaften der Reparaturschablone darstellt, die synthetisiert wurde, um drei vorzeitige Stoppcodons in das rbm-3.2-Gen einzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Experimentelle Zeitleiste zur Erzeugung homozygoter C. elegans durch CRISPR/Cas9-Bearbeitung unter Verwendung vormontierter Ribonukleoproteinkomplexe und dpy-10 als Co-CRISPR-Marker. Eine tägliche Aufschlüsselung der Schritte, die durchgeführt werden müssen, um homozygote C. elegans mit dieser Methode der CRISPR/Cas9-Bearbeitung zu generieren. Kurz gesagt, 30 Würmer wurden mit dem CRISPR-Editing-Mix mittels Mikroinjektion injiziert und auf einzelne MYOB-Platten getrennt, die mit OP50 E. coligesät waren. Nach 24 Stunden wurden die injizierten P0-Würmer auf frische neue MYOB-Platten übertragen und durften weiterhin Eier legen. An den Tagen 3 und 4 nach der Mikroinjektion wurden die Platten auf das Vorhandensein von Rol F 1-Würmern untersucht. Die Platten mit der maximalen Anzahl von Rol- und Dpy F1-Würmern wurden ausgewählt und 73 F1 Rol-Würmer (wir wählen normalerweise zwischen 50 und 100 F1 Rol-Würmer pro CRISPR-Experiment) wurden auf neue einzelne MYOB-Platten (1 Wurm pro Teller) eingelegt und für etwa 2 Tage Eier legen gelassen. An Tag 6 nach der Mikroinjektion wurden Wurmlysate aus denF1-Würmern hergestellt, die Nachkommen produziert hatten (F2),und auf das Vorhandensein der Bearbeitung mittels PCR untersucht, gefolgt von einer Restriktionsverdauung mit EcoRI und Agarosegelelektrophorese. An Tag 7 wurden 12 Nicht-Rol-, Nicht-Dpy-F2-Würmer von den positiven Platten auf neue Einzelplatten übertragen und durften Nachkommen produzieren (F3). An Tag 9 wurden die F2-Würmer wie zuvor beschrieben auf Homozygotie des Edits untersucht. An Tag 10 wurden Wurmlyse, PCR und PCR-Bereinigung für die homozygotenF3-Würmer durchgeführt und die DNA-Konzentration mit einem NanoDrop-Spektralphotometer gemessen. An Tag 11 wurden Sanger-Sequenzierungsreaktionen für positive Proben eingerichtet und die Reaktionen zur DNA-Sequenzierung gesendet. An Tag 12 wurden die Sequenzierungsergebnisse analysiert und das Vorhandensein der Bearbeitung mit einer Sequenzanalysesoftware (z. B. CLC Sequence Viewer) überprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Screening auf heterozygote C. elegans für die rbm-3.2-Frühstopp-Codons. Agarose-Gel-Elektrophorese-Bilder von C. elegans genomischer PCR-DNA, die mit EcoRI verdaut wurden. 73 einzelne F1-Würmer wurden genotypisiert und auf das Vorhandensein des rbm-3.2-Edits untersucht. Rote Zahlen und Sternchen weisen auf positiv bearbeitete Würmer hin. Alle 7 identifizierten positiv editierten C. elegans waren heterozygot für den Edit, da sie ein unbearbeitetes Wildtyp-DNA-Fragment von 445 bp und zwei DNA-Fragmente von 265 bp bzw. 166 bp aus der bearbeiteten Kopie des rbm-3.2-Gens bei EcoRI-Verdauung zeigten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Identifizierung und Verifizierung homozygoter editierter C. elegans, die die rbm-3.2 vorzeitigen Stoppcodons tragen. A. (A). Screening auf C. elegans, die homozygot für die rbm-3.2 vorzeitigen Stopp-Codonssind. Agarose-Gel-Elektrophorese-Bilder von C. elegans genomischer DNA, die mit EcoRI verdaut wurden. 12 einzelneF2-Würmer aus positiven Platten wurden genotypisiert und auf Homozygotie des rbm-3.2-Edits untersucht. Rot: homozygote editierte Würmer. 6 der 12 gescreentenF2-Würmer (50%) waren homozygot für die rbm-3.2-Frühstopp-Codons. Für Wurm 7 war kein PCR-Produkt vorhanden. B. Bestätigung der Insertion der vorzeitigen Stoppcodons in rbm-3.2 durch DNA-Sequenzierung. Schematisch, das den Vergleich von DNA- und Proteinsequenzen von unbearbeiteten und bearbeiteten Homozygoten zeigt. Die Analyse der DNA-Sequenzierungsergebnisse genomischer DNA von homozygoten editierten Würmern bestätigte das Vorhandensein der drei vorzeitigen Stoppcodons im rbm-3.2-Gen bei CRISPR/Cas9-Bearbeitung. Alle resultierenden Aminosäureveränderungen nach der CRISPR/Cas9-Bearbeitung sind entweder in roten Buchstaben oder roten Sternchen gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Wir haben das obige Protokoll verwendet, um neben rbm-3.2 mehrere Gene zu bearbeiten. Unsere Bearbeitungseffizienzen für verschiedene Loci, Guide-RNAs und Reparaturvorlagen (einzelsträngig und doppelsträngig) schwankten zwischen 2% und 58% (Daten nicht gezeigt). Die beobachteten Bearbeitungseffizienzen sind vergleichbar mit den zuvor gemeldeten Bearbeitungseffizienzen von 2% bis 70% für dieses Protokoll²⁷. Wir waren auch erfolgreich bei der Verwendung dieser Technik bei der Herstellung von Gen-Deletionen. Mit zwei crRNAs ersetzten wir ein Gen, das fast 6 kb lang ist, durch die kodierende Sequenz für grün fluoreszierendes Protein (GFP) (Daten nicht gezeigt). Für dieses Experiment wurden etwa 14% der analysierten Rol F_1-Würmer als positiv für die Gend deletion und den Ersatz durch GFP befunden (Daten nicht gezeigt). Es sind jedoch zusätzliche Experimente erforderlich, um die maximale Länge von Genstreichungen und -ersetzungen zu bestimmen, die mit dieser Technik durchgeführt werden können.

Diese Technik kann verwendet werden, um Einfügungen von etwa 1,6 kb Länge^{19 zu machen.} Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass für Insertionen, die mit diesem Protokoll über 1,6 kb lang sind, die Erzeugung von zwei Doppelstrangbrüchen und die Verwendung von Reparaturvorlagen mit längeren Homologiearmen das Einfügen von viel größeren DNA-Fragmenten (~ 10 Kb) ermöglichen kann²⁸. Alternativ können mehrere Runden der Genbearbeitung mit diesem Protokoll durchgeführt werden, um größere Bearbeitungen zu generieren. Andere plasmidbasierte C. elegans CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Protokolle können auch für CRISPR-Experimente übernommen werden, bei denen DNA-Fragmente größer als 1,6 kb eingefügt werden⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸.

Bevor dieses Protokoll für die Genbearbeitung verwendet wird, muss sichergestellt werden, dass das interessierende Gen nicht mit dem dpy-10-Locus auf Chromosom II verknüpft ist. Wenn ein Zielgen mit dpy-10verknüpft ist, kann es problematisch sein, die dpy-10-Mutation von Ihrem edit of interest zu trennen. Für den Fall, dass das interessierende Gen mit dem dpy-10-Locus verknüpft ist, können daher andere Co-CRISPR-Marker wie unc-58 (X-Chromosom),unc-22 oder zen-4 (Chromosom IV) und ben-1 oder pha-1 (Chromosom III) verwendet werden, die sich auf verschiedenen Chromosomen befinden²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁸. Daten aus dem Meyer-Labor zeigen, dass Ben-1- und Zen-4-Mutationen mit dieser Methode als erfolgreiche Co-CRISPR-Marker für das Screening verwendet werden können²⁸. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Verwendung von Zen-4 und Pha-1 als Co-CRISPR-Marker die Durchführung des CRISPR-Experiments in Nicht-Wildtyp-Zen-4(cle10 ts) oder Pha-1(e2123ts) Hintergründen bzw.²⁶^,²⁸erfordert. Darüber hinaus können CRISPR-Experimente mit einigen Co-CRISPR-Markern wie Ben-1 die Herstellung spezieller Platten (z. B. Benzimidazol enthaltende Platten)^{erfordern 28}. Wir haben den unc-58 co-CRISPR-Marker erfolgreich verwendet, um nach positiven Bearbeitungen für ein Gen zu suchen, das mit dieser Methode mit dem dpy-10 verknüpft ist (Daten nicht gezeigt). Die unc-58(e665)-Mutation verleiht einen sichtbaren Phänotyp (Lähmung), der effektiv zum Screening auf positiv editierte Würmer verwendet werden kann²⁴. Alternativ, wenn der Zugang zu einem Fluoreszenzmikroskop verfügbar ist, kann ein fluoreszierend markiertes gtbp-1-Gen auch als Co-CRISPR-Marker für dieses Protokoll verwendet werden¹⁹.

Für eine hohe Bearbeitungseffizienz bei verwendung dieser Methode der Genombearbeitung muss sich die Bearbeitungsstelle innerhalb von 10 bis 30 Basen von der Cas9-Schneidestelle befinden. Wenn die Bearbeitungsstelle über 30 Basen von der Cas9-Schneidestelle entfernt ist, sinkt die Bearbeitungseffizienz drastisch¹⁹^,³⁵^,³⁷. Eine aktuelle Studie aus dem Meyer-Labor hat jedoch gezeigt, dass das Erstellen von zwei Doppelstrangbrüchen in einem Abstand voneinander das Einfügen von Bearbeitungen weit weg von der Cas9-Schnittstelle mit diesem Protokoll ermöglichen kann²⁸.

Im aktuellen Protokoll wurde die Reparaturvorlage so konzipiert, dass alle drei eingefügten Stoppcodons im selben Leserahmen erscheinen. Eine alternative Strategie zur Herstellung von Nullmutanten wäre jedoch die Verwendung einer universellen 43-basen langen Knock-in-STOP-IN-Kassette, die zuvor beschrieben wurde⁵⁰. Wichtig ist, dass diese Kassette Stop-Codons in allen drei möglichen Leserahmen hat und Frameshift-Mutationen verursacht. Dies ist eine besonders nützliche Strategie zum Generieren von Nullmutanten, wenn an der Bearbeitungsstelle eine unsachgemäße oder unvollständige Reparatur auftritt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies aufgrund seiner kurzen Dauer und der jüngsten Fortschritte bei dieser Methode eine ausgezeichnete Methode für routinemäßige Laborexperimente ist, bei denen kurze immunogene Epitop-Tags, fluoreszierende Tags, Gendy deletionen, Genersatz und Codonsubstitutionen hinzugefügt werden.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Start-up-Fonds der University of Tulsa (TU) und das TU Faculty Development Summer Fellowship an Jyoti Iyer unterstützt. Wir danken dem Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) und der Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) für die Vergabe von Stipendien an die an dieser Studie beteiligten Studenten. Wir danken Frau Caroline Dunn für ihre technische Unterstützung. Abschließend möchten wir Dr. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter und Saili Moghe für ihre kritischen Kommentare zu diesem Manuskript danken.

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Premixed	N/A
Cas9 protein	PNA Bio	CP01	Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	N/A	Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI	New England Biolabs	R3101S	Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit	Qiagen	28004	Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix	Meridian Bioscience	BIO-25043	Stored at -30 °C
Primers	IDT	N/A	Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K	Gold Bio	P-480-SL4	Stored at -30 °C
Repair template oligos	IDT	N/A	4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	U-002005-50	Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C

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Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).