De E1A Minigene Tool gebruiken om mRNA-splicingwijzigingen te bestuderen
Summary
Dit protocol biedt een snel en nuttig hulpmiddel voor het evalueren van de rol van een eiwit met een niet-gekarakteriseerde functie in alternatieve splicing-regulatie na chemotherapeutische behandeling.
Abstract
mRNA-verwerking omvat meerdere gelijktijdige stappen om mRNA voor te bereiden op vertaling, zoals 5’capping, poly-A-toevoeging en splicing. Naast constitutief splicing maakt alternatieve mRNA-splicing de expressie van multifunctionele eiwitten uit één gen mogelijk. Aangezien interactoomstudies over het algemeen de eerste analyse zijn voor nieuwe of onbekende eiwitten, is de associatie van het aaseiwit met splicingfactoren een indicatie dat het kan deelnemen aan het mRNA-splicingproces, maar om te bepalen in welke context of welke genen worden gereguleerd, is een empirisch proces. Een goed uitgangspunt om deze functie te evalueren is het gebruik van de klassieke minigene tool. Hier presenteren we het adenovirale E1A minigene gebruik voor het evalueren van de alternatieve splicing veranderingen na verschillende cellulaire stress stimuli. We evalueerden de splicing van E1A minigene in HEK293 stabiel overexpressie Nek4 eiwit na verschillende stress behandelingen. Het protocol omvat E1A minigene transfectie, celbehandeling, RNA extractie en cDNA synthese, gevolgd door PCR en gel analyse en kwantificering van de E1A gesplitste varianten. Het gebruik van deze eenvoudige en gevestigde methode in combinatie met specifieke behandelingen is een betrouwbaar uitgangspunt om licht te werpen op cellulaire processen of welke genen kunnen worden gereguleerd door mRNA-splicing.
Introduction
Splicing is een van de belangrijkste stappen in eukaryotische mRNA-verwerking die gelijktijdig plaatsvindt met 5’mRNA-aftopping en 3’mRNA-polyadenylation, bestaande uit intronverwijdering gevolgd door exon-verbinding. De herkenning van de splicingplaatsen (SS) door het spliceosoom, een ribonucleoproteïnecomplex dat kleine ribonucleoproteïnen (snRNP U1, U2, U4 en U6), kleine RNA’s (snRNAs) en verschillende regulerende eiwitten1 bevat, is noodzakelijk voor het splicen.
Naast intronverwijdering (constitutieve splicing), kunnen in eukaryoten introns worden behouden en exonen worden uitgesloten, waardoor het proces genaamd mRNA alternative splicing (AS) wordt geconfigureerd. De alternatieve pre-mRNA-prothese breidt de codeercapaciteit van eukaryotische genomen uit, waardoor een groot en divers aantal eiwitten uit een relatief klein aantal genen kan worden voortgekregen. Geschat wordt dat 95-100% van de menselijke mRNAs die meer dan één exon bevatten , alternatieve spen kunnen ondergaan2,3. Dit is fundamenteel voor biologische processen zoals neuronale ontwikkeling, apoptoseactivatie en cellulaire stressrespons4, waardoor het organisme alternatieven biedt om het functioneren van cellen te reguleren met behulp van hetzelfde repertoire van genen.
De machines die nodig zijn voor alternatieve splicing worden dezelfde gebruikt voor constitutieve splicing en het gebruik van de SS is de belangrijkste determinant voor het optreden van alternatieve splicing. Constitutief splicing houdt verband met het gebruik van sterke splicingsites, die meestal meer lijken op consensusmotieven voor spliceosome-herkenning5.
Alternatieve exonen worden meestal minder efficiënt herkend dan constitutieve exonen zodra de cis-regulerendeelementen, de sequenties in 5’SS en 3’SS die deze exons flankeren, een inferieur bindingsvermogen vertonen voor het spliceosome. mRNA bevat ook gebieden met de naam versterkers of geluiddempers in exonen (exonische splicing enhancers (ESE’s) en exonische splicing silencers (ESSs)) en introns (intronic splicing enhancers (ISE’s) en intronic splicing silencers (ISSs)) die het exongebruik verbeteren of onderdrukken, respectievelijk5. Deze sequenties worden herkend door transregulerende elementen of splicingfactoren (SF). SF’s worden voornamelijk vertegenwoordigd door twee families van eiwitten, de serine/argininerijke splicingfactoren (SRSF’s) die zich binden aan ESE’s en de familie van heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen (hnRNPs) die zich binden aan ESSs-sequenties5.
Alternatieve splicing kan worden gemoduleerd door fosforylering/defosforylatie van transfactoren die de interactiespartners en cellulaire lokalisatie van splicingfactorenwijzigen 6,7,8. Het identificeren van nieuwe regulatoren van splicingfactoren kan nieuwe instrumenten bieden om splicing en bijgevolg sommige kankerbehandelingen te reguleren.
Anufrieva et al.9, in een mRNA microarray genexpressieprofiel, waargenomen consistente veranderingen in de niveaus van spliceosomal componenten in 101 cellijnen en na verschillende stressomstandigheden (platina-gebaseerde geneesmiddelen, gammastraling, topoisomeraseremmers, tyrosinekinaseremmers en taxanen). De relatie tussen splicing patroon en chemotherapie werkzaamheid is al aangetoond in longkanker cellen, die chemotherapie resistent zijn, met veranderingen in caspase-9 varianten tarief10. HEK293 cellen behandeld met chemotherapeutica panel vertonen veranderingen in splicing met een toename van pro-apoptotische varianten. Gabriel et al.11 waargenomen veranderingen in ten minste 700 gebeurtenissen van splicing na cisplatine behandeling in verschillende cellijnen, erop wijzend dat splicing paden zijn cisplatine-beïnvloed. Splicing modulatoren hebben al aangetoond anti-tumor activiteit, waaruit blijkt dat splicing is belangrijk voor de ontwikkeling van de tumor en, voornamelijk, chemotherapie respons12. Daarom is het karakteriseren van nieuwe eiwitten die splicing reguleren na cellulaire stressoren, zoals chemotherapeutica, erg belangrijk om nieuwe behandelingsstrategieën te ontdekken.
De aanwijzingen van alternatieve splicing-regulatie uit interactoomstudies, met name belangrijk om functies van nieuwe of niet-gekarakteriseerde eiwitten te karakteriseren, kunnen een meer algemene en eenvoudige benadering vereisen om de echte rol van het eiwit in AS te verifiëren. Minigenen zijn belangrijke instrumenten voor de analyse van de algemene rol van een eiwit dat de splicing-regulatie beïnvloedt. Zij bevatten segmenten van een interessant gen dat alternatief gesplitleerde en flankerende genomische gebieden bevat13. Het gebruik van een minigene-tool maakt de analyse van het splitsen in vivo mogelijk met verschillende voordelen, zoals de lengte van het minigeen dat klein is en daarom geen beperking is voor de versterkingsreactie; hetzelfde minigeen kan in verschillende cellijnen worden geëvalueerd; alle cellulaire componenten, voornamelijk hun regulerende post-translationele modificatie (fosforylering en veranderingen in celcompartimenten) zijn aanwezig en kunnen worden aangepakt13,14. Bovendien kunnen veranderingen in het alternatieve splicingpatroon worden waargenomen na cellulaire stress en, het gebruik van een minigeensysteem, maken het mogelijk om de route te identificeren die wordt gemoduleerd door verschillende stimuli.
Er zijn al verschillende minigene-systemen beschreven die specifiek zijn voor verschillende soorten splicing-gebeurtenissen13,14, maar als voorlopige test is de minigene E1A15 een zeer goed ingeburgerd alternatief splicing reporter-systeem voor de studie van 5’SS-selectie in vivo. Uit slechts één gen, E1A, worden vijf mRNAs geproduceerd door alternatieve splicing op basis van selectie van drie verschillende 5′ splice-sites en van één belangrijke of een kleine 3′ splice-site16,17,18. De expressie van E1A-varianten verandert afhankelijk van de periode van Adenovirale infectie19,20.
We hebben eerder aangetoond dat beide Nek4-isovormen interageren met splicingfactoren zoals SRSF1 en hnRNPA1 en terwijl isoform 2 minigene E1A alternatieve splicing verandert, heeft isoform 1 geen effect in dat21. Omdat isovorm 1 de meest voorkomende isovorm is en de chemotherapieresistentie en DNA-schaderespons verandert, evalueren we of het minigene E1A alternatieve splicing in een stresstoestand kan veranderen.
Minigene-assay is een eenvoudige, goedkope en snelle methode, omdat het alleen RNA-extractie, cDNA-synthese, versterking en agarosegelanalyses nodig heeft en een nuttig hulpmiddel kan zijn om te evalueren, omdat een mogelijk effect op alternatieve splicing door een eiwit van belang tot het effect van verschillende behandelingen op cellulair alternatief splicingpatroon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minigenes zijn belangrijke instrumenten om de effecten in wereldwijde alternatieve splicing in vivo te bepalen. De adenovirale minigene E1A wordt al tientallen jaren met succes gebruikt om de rol van eiwitten te evalueren door de hoeveelheid hiervan in cel13,14te verhogen . Hier stellen we het minigene E1A-gebruik voor voor het evalueren van alternatieve splicing na chemotherapeutische blootstelling. Een stabiele cellijn die Nek4 isoform 1 uitdrukte, werd gebruik…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, via Grant Temático 2017/03489-1 aan JK en fellowship aan FLB 2018/05350-3) en de Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) voor de financiering van dit onderzoek. We willen dr. Adrian Krainer bedanken voor het leveren van de pMTE1A plasmide en Zerler en collega’s voor hun werk in het klonen van E1A. We danken ook Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti en Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller om ons in staat te stellen hun laboratoriumruimte en apparatuur te gebruiken.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Referencias
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
