Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm
Summary
Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.
Abstract
El procesamiento del ARNm implica múltiples pasos simultáneos para preparar el ARNm para la traducción, como el 5’capping, la adición de poli-A y el empalme. Además del empalme constitutivo, el empalme alternativo del ARNm permite la expresión de proteínas multifuncionales a partir de un gen. Como los estudios de interactomas son generalmente el primer análisis de proteínas nuevas o desconocidas, la asociación de la proteína de cebo con factores de empalme es una indicación de que puede participar en el proceso de empalme de ARNm, pero determinar en qué contexto o qué genes están regulados es un proceso empírico. Un buen punto de partida para evaluar esta función es el uso de la herramienta clásica de minigene. Aquí presentamos el uso del minigene adenoviral E1A para evaluar los cambios que empalme alternativos después de diversos estímulos celulares de la tensión. Se evaluó el empalme del minigén E1A en HEK293 establemente sobreexpresando la proteína Nek4 después de diferentes tratamientos de estrés. El protocolo incluye transfección de minigenes E1A, tratamiento celular, extracción de ARN y síntesis de ADNc, seguido de pcr y análisis de gel y cuantificación de las variantes empalmeadas E1A. El uso de este método simple y bien establecido combinado con tratamientos específicos es un punto de partida confiable para arrojar luz sobre los procesos celulares o qué genes pueden ser regulados por el empalme de ARNm.
Introduction
El empalme es uno de los pasos más importantes en el proceso eucariota del mRNA que ocurre simultáneamente al 5′ mRNA que tapa y al 3′ poliadenylation del mRNA, comprendiendo del retiro del intrón seguido por la ensambladura del exón. El reconocimiento de los sitios que empalaban (SS) por el spliceosome, un complejo del ribonucleoprotein que contiene las pequeñas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 y U6), los pequeños RNAs (snRNAs) y varias proteínas reguladoras1 es necesario para empalmar.
Además de la extirpación de intrones (empalme constitutivo), en los eucariotas se pueden retener los intrones y se pueden excluir los exones, configurando el proceso llamado empalme alternativo de ARNm (EA). El empalme alternativo pre-ARNm amplía la capacidad de codificación de los genomas eucariotas permitiendo la producción de un número grande y diverso de proteínas a partir de un número relativamente pequeño de genes. Se estima que el 95-100% de los ARNm humanos que contienen más de un exón pueden someterse a empalme alternativo2,3. Esto es fundamental para procesos biológicos como el desarrollo neuronal, la activación de la apoptosis y la respuesta al estrés celular4,proporcionando al organismo alternativas para regular el funcionamiento celular utilizando el mismo repertorio de genes.
La maquinaria necesaria para el empalme alternativo es la misma utilizada para el empalme constitutivo y el uso de las SS es el principal determinante para la ocurrencia de empalme alternativo. El empalme constitutivo está relacionado con el uso de sitios de empalme fuerte, que suelen ser más similares a los motivos de consenso para el reconocimiento de spliceosomas5.
Los exones alternativos se reconocen típicamente menos eficientemente que los exones constitutivos una vez que sus elementos reguladores cis-,las secuencias en 5′ SS y 3′ SS flanqueando estos exones, demuestre una capacidad obligatoria inferior al emposoma. El ARNm también contiene regiones denominadas potenciadores o silenciadores ubicados en exones (potenciadores de empalme exónico (ESEs) y silenciadores de empalme exónicos (ESSs)) e intrones (potenciadores de empalme intrónico (ISEs) y silenciadores de empalme intrónico (ISSs)) que mejoran o reprimen el uso de exones, respectivamente5. Estas secuencias son reconocidas por elementos trans-reguladores, o factores de empalme (SF). Las SFs están representadas principalmente por dos familias de proteínas, los factores de empalme ricos en serina/arginina (SRSFs) que se unen a las EES y la familia de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs) que se unen a las secuencias deLASE 5.
El empalme alternativo puede ser modulado por fosforilación/desfosforilación de factores trans que modifican las interacciones de los socios y localización celular de los factores de empalme6,7,8. La identificación de nuevos reguladores de los factores de empalme puede proporcionar nuevas herramientas para regular el empalme y, en consecuencia, algunos tratamientos contra el cáncer.
Anufrieva et al.9,en un perfil de expresión génica de microarrays de ARNm, observaron cambios consistentes en los niveles de componentes spliceosomales en 101 líneas celulares y después de diferentes condiciones de estrés (fármacos a base de platino, irradiación gamma, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de la tirosina cinasa y taxanos). La relación entre el patrón de empalme y la eficacia de la quimioterapia ya se ha demostrado en células cancerosas de pulmón, que son resistentes a la quimioterapia, mostrando cambios en la tasa de variantes de la caspasa-910. Las células HEK293 tratadas con panel quimioterapéutico muestran cambios en el empalme con un aumento en las variantes pro-apoptóticas. Gabriel et al.11 observaron cambios en al menos 700 eventos de empalme después del tratamiento con cisplatino en diferentes líneas celulares, señalando que las vías de empalme están afectadas por el cisplatino. Los moduladores del empalme ya han demostrado actividad antitumoral, mostrando que el empalme es importante para el desarrollo tumoral y, principalmente, para la respuesta quimioterápica12. Por lo tanto, caracterizar nuevas proteínas que regulan el empalme después de agentes estresores celulares, como la quimioterapia, es muy importante para descubrir nuevas estrategias de tratamiento.
Las pistas de la regulación alternativa del empalme de estudios del interactome, particularmente importantes para caracterizar funciones de proteínas nuevas o no caracterizados, pueden exigir un acercamiento más general y simple para verificar el papel real de la proteína en COMO. Los minigenes son herramientas importantes para el análisis del papel general de una proteína que afecta a la regulación del empalme. Contienen segmentos de un gen de interés que contiene regiones genómicas alternativamente empalmadas y flanqueantes13. El uso de una herramienta minigénica permite el análisis del empalme in vivo con varias ventajas como la longitud del minigén que es menor y por lo tanto no es una limitación a la reacción de amplificación; el mismo minigén se puede evaluar en diferentes líneas celulares; todos los componentes celulares, principalmente su modificación postraduccional reguladora (fosforilación y cambios en los compartimentos celulares) están presentes y pueden ser abordados13,14. Por otra parte, se pueden observar cambios en el patrón de empalme alternativo después del estrés celular y, el uso de un sistema de minigenes, permiten identificar la vía modulada por diferentes estímulos.
Hay varios sistemas de minigenes ya descritos que son específicos para diferentes tipos de eventos de empalme13,14, sin embargo, como un ensayo preliminar, el minigén E1A15 es un sistema de reportero de empalme alternativo muy bien establecido para el estudio de la selección de 5 SS in vivo. A partir de un solo gen, E1A, cinco ARNm se producen por empalme alternativo basado en la selección de tres diferentes sitios de empalme de 5 ′ y de uno mayor o un menor 3 ′ sitio de empalme16,17,18. La expresión de las variantes de E1A cambia según el período de infección adenoviral19,20.
Hemos demostrado previamente que ambas isoformas Nek4 interactúan con factores de empalme como SRSF1 y hnRNPA1 y mientras que la isoforma 2 cambia el splicing alternativo del minigén E1A, la isoforma 1 no tiene ningún efecto en esa21. Porque el isoform 1 es el isoform más abundante y cambia resistencia de la quimioterapia y respuesta del daño de la DNA, evaluamos si podría cambiar el empalme alternativo del minigene E1A en una condición de la tensión.
El ensayo de minigene es un método sencillo, de bajo coste y rápido, ya que solo necesita extracción de ARN, síntesis de ADNc, amplificación y análisis de gel de agarosa, y puede ser una herramienta útil para evaluar desde un posible efecto sobre el empalme alternativo por una proteína de intereses hasta el efecto de diferentes tratamientos sobre el patrón de empalme alternativo celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los minigenes son herramientas importantes para determinar los efectos en el empalme alternativo global in vivo. El minigén adenoviral E1A se ha utilizado con éxito durante décadas para evaluar el papel de las proteínas aumentando la cantidad de estas en la célula13,14. Aquí, proponemos el uso del minigén E1A para evaluar el empalme alternativo después de la exposición quimioterapéutica. Una línea celular estable que expresaba el isoform 1 Nek4 fue uti…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, a través de grant temático 2017/03489-1 a JK y beca a FLB 2018/05350-3) y al Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) por financiar esta investigación. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Adrian Krainer por proporcionar el plásmido pMTE1A y a Zerler y sus colegas por su trabajo en la clonación E1A. También agradecemos a la Prof. Dra. Patrícia Moriel, a la Prof. Dra. Wanda Pereira Almeida, al Prof. Dr. Marcelo Lancellotti y a la Prof. Dra. Karina Kogo Cogo Müller por permitirnos utilizar su espacio y equipo de laboratorio.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Referencias
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