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Comportamiento

ミトコンドリア病の ケノハブディティス・エレガンス モデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

Published: April 04, 2021
doi:
10.3791/62244
, , , ,
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics,The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics,University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

本研究は、C.エレガン複合体I病ガス-1(fc21)ワーム、すなわちZebraLab(中スループットアッセイ)とWormScan(ハイスループットアッセイ)における2つの半自動運動活動分析アプローチのプロトコルを提示し、ネマトデ挙動と統合神経筋機能を定量化するための広範な研究方法の間で比較分析を提供する。

Abstract

カエノハブディティス・エレガンスは、多様なヒト疾患のメカニズムや治療法を効率的に問い合わせた翻訳動物モデルとして、その中心的な有用性が広く認められています。ワームは、高速開発サイクル、大きなブロードサイズ、短寿命、顕微鏡的透明性、低いメンテナンスコスト、ゲノムツールの堅牢なスイート、変異型リポジトリ、および生体内およびex vivo生理学の両方を尋問する実験的方法論を利用することによって、治療目標と治療法に関するより深い洞察を得るために、ハイスループットの遺伝的および薬物スクリーンに特に適しています。ワーム運動活動は、原因および症状において非常に不均質であるが、細胞エネルギーを産生する能力の低下を総称して共有するミトコンドリア病において頻繁に障害される特に関連する表現型を表す。一連の方法論は、ワームの動作を問い合わせて使用できますが、これらは、実験コスト、複雑さ、およびゲノムまたは薬物のハイスループット画面の有用性で大きく異なります。ここでは、16種類の活動分析方法論の相対的なスループット、利点、および限界を比較して、異なる段階、年齢、および実験期間におけるC.エレガンスの単一ワームまたはワーム集団における線球移動、スラッシング、咽頭ポンピング、および/または気化を定量化した。利用可能なソフトウェアツールの新しいアプリケーション、すなわちZebraLab(中スループットアプローチ)とWormScan(ハイスループットアプローチ)を表す線虫運動活動を定量化する2つの半自動化された方法について、詳細なプロトコルが実証されました。これらの方法を適用したデータは、L4幼虫期で同様の程度の動物活動が起こったことを示し、1日目成人において、ミトコンドリア複合体I病(gas-1(fc21))の変異型の野生型(N2ブリストル)C.エレガンスにおいて進行した。このデータは、ミトコンドリア病の前臨床動物モデルにおけるワーム行動に関する高スループット薬物スクリーニングをサポートする可変容量を有する、ZebraLabまたはWormScanソフトウェアツールを使用してワーム運動活動を効率的かつ客観的に定量化するこれらの新しいアプリケーションの有用性を検証する。

Introduction

カエノハビディティス・エレガンスは、固体培地上の交配、給餌、卵子産、排便、水泳、移動を含むすべてのワーム行動を調整する302ニューロンを有することに基づく神経科学における優れたモデルとして広く認識されている。これらの雌雄同体線虫はまた、そのよく特徴付けられるゲノムとC.エレガンスとヒト2、3、4の間の〜80%遺伝子の高相同性によって可能にされる、幅広い種類のヒト疾患メカニズムを理解するために広く使用されている。C.エレガンスは長い間、ヒトミトコンドリア病5、6、7、8、9、10を尋問するために使用されてきましたが、これは、細胞エネルギーを生成する能力を損ない、神経筋機能、運動不耐症、疲労を実質的に損なう臨床的に存在する遺伝性代謝障害の非常に遺伝的および典型的な不均一なグループである11 、12,13,14.この目的のために、C.エレガンスモデルの使用は、ミトコンドリア病の異なる遺伝的サブタイプにおける動物活動および神経筋機能の定量的側面の前臨床モデリングと、神経筋機能および全体的な活動を改善する可能性のある候補療法への反応を可能にする。

C.エレガンスにおける神経筋活性は、固体または液体培地の機能的分析を可能にする手動および半自動化アプローチの両方を含む様々な実験方法論によって客観的に測定可能である(表1)1、15。C.エレガンス活性の正確な定量は、筋肉および神経系16、17、18の機能および発達に関連する発見を可能にするために重要であることが証明されている。この研究は、発達段階と年齢の範囲でのベースラインと候補療法への応答の両方で、C.エレガンス病モデルの4つの主要な結果に対する神経筋機能と活動を評価するために研究室で行うことができる17の異なるアッセイの実験要件、利点、および限界を要約し、比較する(表1).実際、この研究は、C.エレガンススラッシング(1分あたりの身体屈曲)、運動活動、咽頭ポンプ、および化学療法の速度を特徴付けるために利用可能な実験的アプローチの範囲の詳細な概要を提供し、各方法の利点と限界を使用し、各方法の利点と限界を実行し、分析するために必要な機器とソフトウェア 高スループットの遺伝的または薬物スクリーニング目的での使用をサポートする各方法のスループット容量。各アッセイのスループット容量は、実験プロトコルの複雑性(ワームのメンテナンス、処理時間、シングルウェルまたはマルチウェルプレートの使用、実験設定およびデータ解析を完了するのに必要な実験時間)に基づいて、低、中、または高と表現されます。

スラッシング19の手動分析、運動活動20、咽頭ポンプ17、21、および走体22、23は、実体顕微鏡24を必要とするワーム活性を評価するための確立された方法論である。ワームのスラッシング活性を測定するには、1分間に身体が曲がる頻度を決定するために液体媒体で分析する必要がありますが、ワームの運動活動は固体媒体または液体媒体で測定することができます。ただし、個々のワームアクティビティの手動分析は、本質的に時間がかかり、ユーザーが生成する避けられないバイアスを伴います。ワーム活動解析の自動化により、ユーザーが生成するバイアスを最小限に抑え、実験スループットを大幅に向上させることができます25.液体メディアにおけるワームスラッシング活動のビデオ録画は、wrMTrck、ImageJプラグイン26を使用して分析することができます。しかし、wrMTrck用に開発された元の実験設定は、単一の液体滴の中であまりにも多くのワームがワームの重複を引き起こしたため、正確な追跡を困難にしたため、その有用性を制限しました。この実験的な制限は27で解決されましたが、wrMTrck法はハイスループットスクリーニングをサポートできません。

ベースラインで、およびC.エレガンスミトコンドリア病モデルの候補療法に応答して、ワームの運動活動を定量化する様々な方法が存在する。これらには、ZebraLab(ビューポイントライフサイエンス)、ティアプシートラッカー28、広視野線虫追跡プラットフォーム(WF-NTP)29、ワームモーテル、ワームウォッチャー30、ワームラボ31、インフィニティチップ32、WMicrotrackerOne33(表1)が含まれます。これらの方法は、複数のワーム株または条件(通常はマルチウェルプレート上)での移動の同時分析を可能にし、それによってより高スループットの薬物スクリーニングアプリケーションをサポートする。これらの方法の中には、高価な機器とオープンアクセスソフトウェアの必要性、実験プロトコルの実行の容易さなど、一般的なユーティリティを制限または強化する可能性のある独自の考慮事項があります。全体として、単一の実験システムまたはプロトコルは、理想的にはすべてのC.エレガンス運動活動実験に適していません。むしろ、特定の研究者の実験目標と要件に最も適した方法を慎重に選択することが重要です。

咽頭ポンプは、C. エレガンスの神経筋活動を評価するもう一つの重要な結果を表す。C.エレガンス咽頭は、20個の筋肉細胞、20個のニューロン、および20個の他の細胞で構成されており、ワームの消化管34、35、36の前端で大腸菌(大腸菌)の摂取を可能にする。咽頭ポンプ速度17、21、37、38を決定するためにいくつかの手動方法が確立されています。ほとんどの方法は、実験観察者21による直接カウントを用いて咽頭ポンプ周波数を可視化し記録するための実体顕微鏡およびカメラの使用に基づいている。自動咽頭ポンプ速度分析は、電気咽頭図(EPG)と呼ぶ細胞外記録を行うことにより可能であり、これは各ポンプ39の持続時間に関する追加情報を提供する。咽頭ポンプ速度分析は、個々のワームがチャンバー40、41に閉じ込められているマイクロ流体システム、WormSpaでも可能です。咽頭ポンプ速度の解析を容易にする市販の方法は、カスタムチップに固定化された単一ワームにおける摂食行動の神経筋の側面を測定、可視化、分析するScreenChipシステム(InVivoバイオシステム)です。この咽頭ポンプ定量アプローチは、薬物、老化、および他の因子42、43、44、45に対する神経および生理学的応答の両方を評価するために使用することができる。

化学療法は、線虫成長培地(NGM)プレートの定義された領域にワームから離れて配置された臭気に応答して C.エレガン スの動きを記述する。この化学運動量応答を評価することは、定義された期間46の中で、ワームが臭気に向かって移動する物理的距離を観察および測定することによって定量可能なワーム神経および神経筋活動の統合的尺度を提供する。マルチワームトラッカーは、刺激剤に向かって、または忌避剤からワームが移動する距離を定量化する実験効率を向上させるために使用することができる自動方法です47.

ここでは、ワーム活性を定量化するために確立された2つの新規の半自動化方法の詳細なプロトコルについて説明する。最初のアプローチは、もともとDanio rerio(ゼブラフィッシュ)の水泳活動を研究するために開発された商用ソフトウェアZebraLabを利用し、動き中のピクセル変化に基づいてC.エレガンスの液体媒体中の全体的なloco運動活性を定量化する新しい中スループットアプリケーションのために(表1、図1)。この方法はマルチウェルプレート形式には適していませんが、多数の同時条件とサンプルをグラススライド上で分析して、データ出力を迅速に取得します。2つ目のアプローチは、WormScanの方法論48、49(図2)の新しい適応であり、フラットベッドスキャナを使用して、オープンソースソフトウェアで可変的に使用できる2つのシーケンシャルスキャンの差分画像を作成し、胎児性や生存などの統合生理学的結果の半自動化された定量的分析を可能にします。ここでは、96ウェルの平底プレートのウェルあたり15の幼虫ステージ4(L4)ワームの集団中の液体培地におけるワームロコモ運動活性を定量化するWormScan方法論の新しいハイスループット適応が開発された。この半自動化および低コストのWormScan方法論は、ハイスループットの薬物スクリーンに容易に適応できるだけでなく、様々な動物の段階および年齢48、49の分析に合わせることができる。

ここで、ゼブララボとワームスキャンの両方の半自動化法を用いてC.エレガンス運動活動を分析するプロトコルと有効性が、ミトコンドリア複合体I病の確立されたC.エレガンスモデル、gas-1(fc21)で実証されている。 gas-1(K09A9.5遺伝子)は、ヒトNDUFS2のオルソログ(NADH:ユビキノンオキシド還元酵素コア(鉄硫黄タンパク質)サブユニット2)である(図3)。C.エレガンスガス-1(fc21)変異株は、NDUFS250のヒト正射体にホモ接合性p.R290Kミスセンス突然変異を運び、胎児性および寿命の有意な減少を引き起こし、呼吸鎖酸化リン酸化(OXPHOS)容量51の障害を引き起こし、ミトコンドリア質量および膜電位を減少させる5、 .ミトコンドリア病を研究するために過去20年間にわたって確立された使用にもかかわらず、ガス-1(fc21)変異体の運動活動は以前には報告されていなかった。ここでは、ZebraLabとWormScanの方法を適用して、野生型(WT、N2 Bristol)ワームと比較して、ガス-1(fc21)の運動活動を独自に定量化し、その方法を検証する方法と、実験プロトコルと情報解析の比較有用性と効率を実証する方法の両方を行いました。ZebraLabソフトウェアは、標的薬物スクリーニングまたは検証研究のための潜在的な適用で、C.エレガンスミトコンドリア病モデルにおけるワーム運動活動のいくつかの同時条件の迅速な定量を可能にした。特にWormScan分析は、化合物ライブラリのハイスループット薬物スクリーンを容易に有効にし、原発性ミトコンドリア病の前臨床C.エレガンスモデルにおける動物の神経筋機能および運動活動を改善するリードを優先するのに適している。

Protocol

1. ZebraLabソフトウェアを使用したガラススライド上の液体メディアにおけるワーム運動活動解析 線虫の成長と取り扱い ネマトード成長培地(NGM)を含むペトリプレート上に C.エレガン スを成長させ、食品源として 大腸菌 OP50と広がります。前に説明した8のように、20°Cでワーム培養を維持する。 時を取った卵を実行するワームを同期させて…

Representative Results

液体媒体中のC.エレガンス・ロコ運動活性の分析は、固体培地上で容易に定量化できない可能性のあるミトコンドリア病ワームモデルの統合表現型を容易に捕捉することができる。ZebraLabは、L4幼虫期の液体培地中のWTwormsに対して、確立されたミトコンドリア複合体I病ガス-1(fc21)株のロコ運動活性を定量化するために使用された。1回の液滴で5ワームの活動を1分間にわたっ…

Discussion

ここでは、ワームスラッシング、移動運動、咽頭ポンピング、気胸など、多様な結果のレベルでC.エレガンス神経筋活動を研究するための詳細な情報と根拠を要約した。16の異なる活動分析方法論の比較は、異なる年齢および実験期間における単一のワームまたはワーム集団における線虫活動を定量化する相対的なスループット、利点、および限界の観点から行われた。これらの中で、…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アンソニー・ロズナー博士は、このプロジェクトの早期準備に対する組織的支援と、プロトコル分析に貢献してくれたエリン・ハウスに感謝しています。この研究は、ジュリエットのキュアFBXL4ミトコンドリア病研究基金、ジャックソン・フリントC12ORF65研究基金、国立衛生研究所(R01-GM120762、R01-GM120762-08S1、R35-GM134863、T32-NS0043)によって資金提供されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも資金提供者または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis
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Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).
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