Este artigo fornece instruções passo a passo para fazer medições de FRET precisas totalmente corrigidas em biomoléculas individuais, difundindo livremente biomoléculas usando o smfBox de código aberto e barato, desde ligar, através do alinhamento e foco, até a coleta e análise de dados.
O smfBox é um instrumento de código aberto e econômico recentemente desenvolvido para transferência de energia de ressonância förster de molécula única (smFRET), que torna as medições em biomoléculas de difusão livremente mais acessíveis. Essa visão geral inclui um protocolo passo-a-passo para o uso deste instrumento para fazer medições de eficiências precisas de FRET em amostras de DNA duplex, incluindo detalhes da preparação e alinhamento da amostra, configuração e alinhamento de instrumentos, aquisição de dados e rotinas completas de análise. A abordagem apresentada, que inclui como determinar todos os fatores de correção necessários para medições precisas de distância derivadas do FRET, baseia-se em um grande conjunto de trabalhos colaborativos recentes em toda a Comunidade FRET, que visa estabelecer protocolos padrão e abordagens de análise. Este protocolo, que é facilmente adaptável a uma gama de sistemas biomoleculares, aumenta os esforços crescentes na democratização do SMFRET para a comunidade científica mais ampla.
A transferência de energia de ressonância Förster de uma molécula única (smFRET) é uma técnica que mede a eficiência do FRET entre dois corantes – um doador e um aceitador -ao nível de moléculas individuais. FRET é um processo fotofísico decorrente do espectro de energia sobreposto de dois corantes: o doador está animado com a luz de um comprimento de onda específico e transfere energia sem radiação para o aceitor, resultando em emissão do aceitador. A eficiência dessa transferência é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre os dois corantes, de modo que a eficiência de transferência varia de acordo com a distância1. Assim, essa eficiência de FRET pode ser usada para determinar informações espaciais sobre a molécula(s)2 à qual os corantes estão ligados, dentro de uma faixa de 3-10 nm. Essa escala, e o fato de que as mudanças na eficiência do FRET são sensíveis aos movimentos moleculares de Angstrom3, torna a técnica adequada para investigar informações estruturais sobre biomoléculas – como ácidos nucleicos e proteínas – sem as complicações do conjunto em média4,5,6. Embora mudanças na eficiência relativa do FRET possam ser usadas para monitorar interações biomoleculares e dinâmicas conformacionais, lançando luz sobre os principais processos celulares, como proteína (un)dobrável, transcrição e replicação e reparo de DNA, eficiências absolutas de FRET têm sido usadas para determinar distâncias precisas para determinação da estrutura biomolecular7,8,9,10,11 , superando a necessidade de cristalização ou congelamento, como é necessário para alguns outros métodos estruturais4,12.
os experimentos smFRET geralmente tomam duas formas, microscopia de fluorescência de reflexão interna confocal ou total (TIRF). Entre ambas as abordagens, a dinâmica molecular das biomoléculas pode ser tipicamente investigada em escalas de tempo do pico- a milissegundo (moléculas confocal, difusas livremente) até milissegundos a horas (TIRF, moléculas imobilizadas da superfície). Isso se deve às diferentes configurações envolvidas em cada técnica. Na microscopia TIRF, as moléculas são imobilizadas na superfície de um slide e excitadas por uma onda evanescente (Figura 1A). Aqui, no entanto, o foco é na microscopia confocal, pois este é o formato do smfBox. Na microscopia confocal, as moléculas não são imobilizadas e, em vez disso, livremente difusas através do movimento browniano através do volume confocal (~1 fL), formado pelo foco de um raio laser através de uma lente de abertura numérica alta em um ponto em alguma profundidade designada dentro da solução (Figura 1B). A emissão resultante é focada de volta através da mesma abertura e filtrada através de um espelho dicroico (Figura 1C para esquema completo). Em seguida, é focado através de um orifício para remover qualquer luz fora de foco e em um fotodiodo de avalanche (APD). Quando o APD detecta um fóton, ele produz um pulso TTL, o tempo do qual pode ser registrado com resolução de até picosegundo. O tempo de observação dessas moléculas de difusão livre nas proximidades do volume confocal é comumente dentro da ordem dos milissegundos.
Figura 1: Esquemas que mostram princípios da microscopia e da configuração smfBox. (A) Princípio de Microscopia de Reflexão Interna Total (TIRF): a luz de excitação é direcionada para a borda do objetivo (Obj.) e sofre total reflexão interna na interface de tampão de tampa gerando um campo de evanescência exponencialmente decadente para excitar moléculas conectadas à superfície. (B) Microscopia Confocal: Moléculas de difusão livre são animadas por um ponto quase difração limitado focado na amostra. (C) A configuração smfBox utilizada neste protocolo, mostrando todos os componentes-chave: fotodiodos de avalanche (APD), divisor de feixe (BS), espelhosdicróicos (DM), filtros (F), espelhos (M), objetivo (O) e pinhole (P). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Mais recentemente, as técnicas smFRET incorporaram duas excitações de cores, onde lasers que correspondem ao doador e comprimentos de onda de excitação aceitadores são alternados5. Isso pode ser feito de uma das duas maneiras, a primeira modulando lasers de ondas contínuas na escala de tempo KHz, que é conhecida como excitação a laser alternada (ALEX)13,14. O segundo método intercala pulsos rápidos na escala de tempo MHz; este é nanossegundo-ALEX15 ou excitação intercalada pulsada (PIE)16. Em todas essas abordagens, a informação do laser aceitador leva ao cálculo da chamada estequiometria, que pode discriminar entre moléculas com baixa eficiência de FRET e aquelas que não possuem um aceitador (seja através de rotulagem incompleta ou fotobleaching). O uso do PIE/ns-ALEX também dá acesso a vidas fluorescentes no nível de molécula única, e as anisotropias podem ser medidas quando associadas à ótica polarizadora. Esta combinação de medidas é conhecida como detecção de fluorescência multiparmétrica (MFD)9.
Apesar das muitas vantagens da SMFRET, ela não é amplamente utilizada fora de laboratórios especializados devido aos altos custos de instrumentos comerciais e à falta de alternativas simples e auto-construídas. Uma tendência crescente para o desenvolvimento de microscopia de origem aberta de baixo custo está ocorrendo e outras plataformas surgiram recentemente, incluindo Plânctonscope17, Microscópio OpenFlexure18, Flexiscope19, miCube20, liteTIRF21 e Squid22. Aqui, o estudo descreve o protocolo para o uso do smfBox, uma configuração confocal recentemente desenvolvida e econômica capaz de medir a eficiência do FRET entre dois corantes em moléculas únicas de difusão livre. Instruções detalhadas de construção e todos os softwares operacionais necessários estão disponíveis gratuitamente em: https://craggslab.github.io/smfBox/ 23. O arranjo óptico do smfBox é montado a partir de componentes prontamente disponíveis comprados de fabricantes acessíveis e amplamente acessíveis, enquanto o corpo do microscópio (responsável pela maior parte da despesa em uma configuração confocal padrão) foi substituído por uma caixa de alumínio anodizado sob medida (permitindo que as medidas sejam feitas sob condições de luz ambiente). Esta caixa abriga componentes ópticos chave, incluindo odicróico de excitação, objetivo e pinalho, e um intertravamento de laser mecânico, permitindo sua operação segura como um produto laser classe I (ver Figura 1C para um esquema completo). O smfBox usa ALEX para validar a estequiometria de corante e determinar fatores precisos de correção de FRET. É operado usando software de código aberto personalizado (smOTTER), que controla todos os aspectos da aquisição de dados e produz os dados no formato fóton-HDF5 de código aberto24, compatível com muitas ferramentas de análise de terceiros. O smfBox e os protocolos de aquisição e análise de dados foram recentemente testados contra >20 outros instrumentos (tanto confocal quanto TIRF) em um estudo cego multi-laboratório25. As eficiências da FRET obtidas estavam em excelente concordância com todos os outros instrumentos, apesar do smfBox custar apenas uma fração do preço das configurações disponíveis comercialmente.
Aqui, um protocolo passo-a-passo é delineado para a aquisição e análise de eficiências irissivas e absolutas precisas sobre a difusão livre de duplexes de DNA usando o smfBox, desde o desligamento, passando pelo alinhamento e foco, até a coleta e análise de dados. As amostras utilizadas aqui são três DNAs duplex (exibindo eficiências de alto, médio e baixo FRET, ver Tabela 1) que foram avaliadas no estudo cego mundial25; no entanto, o método é adaptável a muitos sistemas moleculares, incluindo proteínas e outros ácidos nucleicos. A esperança é que um protocolo tão detalhado, juntamente com as instruções de construção já existentes para o smfBox23, ajude a tornar essa técnica poderosa ainda mais acessível a uma ampla gama de laboratórios.
Os passos mais críticos do protocolo são o alinhamento do microscópio e o ajuste da concentração amostral à diluição correta. Se o alinhamento estiver desligado, então pode haver sinal insuficiente para identificar rajadas e traçar histogramas, e se ocorrer desalinhamento entre as amostras, a correção precisa do FRET pode falhar devido a alterações na eficiência de vazamento e detecção/excitação. O uso de uma concentração apropriada também é importante, uma concentração muito alta dará rajadas coincidentes, contendo múltiplas moléculas com eficiências de FRET potencialmente diferentes ou rotulagem de estequiometrias. Uma concentração muito baixa dará poucas rajadas para análise robusta de dados.
O protocolo descrito aqui é para medir distâncias em espécies estáticas de fret único. Se a amostra tiver mais de um pico no histograma de eficiência FRET, ou os picos parecerem largos (o que pode acontecer com espécies dinâmicas), então mais rajadas podem ser necessárias para encaixar histogramas no mesmo grau de precisão. Para dois picos bem separados, aproximadamente o dobro de dados será necessário, mas se as populações se sobreporem ligeiramente, então ainda mais dados são necessários.
Se as duas populações se interconvertem na escala de tempo do experimento, a dinâmica e cinética do sistema podem ser potencialmente determinadas. Testes como BVA27 e 2CDE28 podem confirmar que as rajadas intermediárias são de natureza dinâmica, enquanto análises incluindo dPDA29,30 ou H2MM31 podem determinar as taxas de interconversão. Os notebooks Jupyter para BVA e 2CDE estão disponíveis no site da FRETBursts26, e o software PAM32, baseado em MATLab, pode executar análises BVA, 2CDE e PDA.
O FRET de molécula única confocal pode facilmente observar estados muito mais curtos (~1 ms) do que o TIRF; no entanto, os curtos tempos de observação, limitados pela difusão, não dão história molecular, e por isso não podem determinar tempos de moradia mais longos, ou redes de transição complexas da maneira que experimentos imobilizados pela superfície podem.
Como o protocolo mede a difusão livre de moléculas em uma concentração muito baixa, ele funciona melhor ao medir distâncias intramoleculares na mesma molécula. Distâncias intermoleculares entre moléculas transitoriamente ligadas podem ser medidas desde que o Kd das duas moléculas seja baixo o suficiente para que o complexo exista em uma quantidade significativa na baixa concentração de trabalho exigida pelo experimento (~100 pM). Se o Kd for muito maior do que isso, então apenas moléculas isoladas rotuladas serão vistas. Esse problema pode ser superado usando microfluidos para misturar os dois componentes rotulados em alta concentração e, em seguida, diluindo e fluindo rapidamente sobre o objetivo antes do complexo dissociar33,34.
Medir a eficiência do FRET no nível de molécula única tem uma vantagem significativa sobre as técnicas de conjunto, pois informa sobre subpopulações heterogêneas, que em um experimento de conjunto seria mediada. Além disso, fret de molécula única com ALEX dá acesso a eficiências precisas de FRET, que podem ser convertidas em distâncias precisas. Isso permite determinar informações estruturais mais detalhadas em vez de simplesmente sondar mudanças relativas de distância. O smfBox carrega todos esses benefícios e capacidades, mas pode ser construído com um orçamento muito menor do que microscópios comercialmente disponíveis comparáveis capazes de confocal smFRET23.
O smfBox representa uma barreira muito menor para a entrada de técnicas de smFRET, permitindo aos pesquisadores medir mudanças conformais e distâncias precisas dentro e entre proteínas e ácidos nucleicos7,8,9,10,11,35.
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem com gratidão as seguintes fontes de financiamento: BBSRC (BB/T008032/1); EPSRC (Studentship to B.A.) e MRC (Studentship to A. R.-T.).
Amino modified oligonucleotide | Eurogentec | N/A | May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes |
Avalanche photodiode (APD) | Excelitas | SPCM-AQRH-14 | Two APDs are required for the smfBox setup |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | A2153 | System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer) |
Compact Laser Combiner | OMICRON | LightHUB-2 | 515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers |
Coverglass | VWR | 630-2742 | Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22×22 mm |
Cy3B | Cytiva | PA63101 | 1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg) |
FRETBursts Python Package | N/A | N/A | Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io |
Imaging Buffer | N/A | System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA | |
Immersion Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
Jupyter notebooks | Project Jupyter | N/A | Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI |
Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | MC-50E is same item in bulk |
Magnesium Chloride | Merck | M2670 | System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer) |
MilliQ/Ultrapure water | N/A | ||
Nanopoistioner | Piezoconcept | FOC300 | Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective |
NHS-ester modified ATTO-550 | ATTO-TEC | AD 550-31 | 1 mg, AD 550-35 (5 mg) |
NHS-ester modified ATTO-647N | ATTO-TEC | AD 647N-31 | 1 mg, AD 647N-35 (5 mg) |
Objective lens | Olympus | N1480700 | Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300 |
OMICRON Control Center (OCC)- laser control center | OMICRON | N/A | v3.5.34 – OMICRON laser driver software |
Press-To-Seal silicone isolator | Grace Bio-Labs | 664201 | 8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth |
smOTTER | N/A | N/A | Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER |
Sodium Chloride | Merck | S7653 | System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer) |
Tris base | Merck | 93362 | System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer) |
Type I ultrapure water | Merck | ZIQ7000T0 | Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System |