硝酸塩および亜硝酸塩測定のためのラット骨格筋ホモジネートの調製
Summary
硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定および比較するために、ラット骨格筋組織の4つの異なる筋肉群を均質化するための3つの異なる方法のプロトコルを提示します。さらに、異なるサンプル重量を比較して、組織のサンプルサイズが均質化の結果に影響を与えるかどうかを調査します。
Abstract
硝酸イオン(NO3–)は、かつて一酸化窒素(NO)代謝の不活性な最終生成物であると考えられていました。しかし、以前の研究では、硝酸イオンは2段階の還元メカニズムによってNOに戻すことができることが実証されました:硝酸塩は主に経口共生細菌によって亜硝酸塩(NO2–)に還元され、次に亜硝酸塩はヘムまたはモリブデン含有タンパク質を含むいくつかのメカニズムによってNOに還元されます。この還元性硝酸塩経路は、特に心血管系および筋肉運動中のNO媒介シグナル伝達経路の増強に寄与する。そのような利用前の体内の硝酸塩のレベルは、主に植物からの内因性NO酸化と食事性硝酸塩摂取の2つの異なる供給源によって決定されます。生理的環境下での複雑なNOサイクルを解明するために、NOと比較して比較的安定な代謝物である硝酸イオンと亜硝酸イオンの動態をさらに調べました。以前の研究では、骨格筋は哺乳類の硝酸イオンの主要な貯蔵器官であり、運動中のNOの直接的な供給源として特定されていました。したがって、骨格筋の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための信頼できる方法論を確立することは重要であり、他の組織サンプルへの適用を拡大するのに役立つはずです。この論文では、硝酸塩と亜硝酸塩の測定のために、3つの異なる均質化方法を使用して骨格筋サンプルの調製について詳しく説明し、サンプルのサイズを含む均質化プロセスに関連する重要な問題について議論します。硝酸塩と亜硝酸塩の濃度も、4つの異なる筋肉グループで比較されています。
Introduction
小さなガス状のシグナル伝達分子である一酸化窒素(NO)は、生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします1。NOは、硝酸塩(NO 3-)およびおそらく亜硝酸塩(NO2-)への急速な酸化を受ける前に、一酸化窒素シンターゼ(NOS)ファミリーの内因性酵素によってL–アルギニンから生成することができます血液および組織2,3。最近、これらのアニオンは哺乳類系においてNOに還元されることが示されている4。硝酸塩は、主に唾液腺から分泌され、直接摂取されたイオンに作用する口腔内の共生細菌硝酸レダクターゼ5、およびある程度はキサンチンオキシドレダクターゼ6,7などの哺乳類の酵素によって亜硝酸塩に変換されます。亜硝酸塩は、デオキシヘモグロビン8、デオキシミオグロビン9、モリブデン含有酵素10、およびプロトン11,12の存在下での非酵素的還元を含むいくつかのメカニズムによってさらにNOに還元することができる。
この硝酸塩-亜硝酸塩-NO経路は、NOSがNO生成4のために酸素を必要とするため、NOS活性が低下する低酸素条件下で増強される。最近の多くの研究では、血圧調節と運動パフォーマンスに対する食事性硝酸塩の有益な効果が報告されており、硝酸塩還元経路がNOシグナル伝達の増強に寄与することが示唆されています13,14,15。以前の研究では、いくつかの骨格筋が体内の主要な硝酸塩貯蔵場所である可能性が高いことが示されています16。血液や肝臓などの他の内臓と比較して、骨格筋(大殿筋)は有意に高いレベルの硝酸塩を含み、哺乳類の体内にかなりの質量を持っています。トレッドミル運動は、ラットモデル7において、亜硝酸塩および大臀筋中のNOへの硝酸塩還元を促進することが示された。これらの結果は、いくつかの骨格筋が生理学的状況における硝酸塩還元経路を介したNOの重要な供給源である可能性があることを示唆しています。より最近の研究では、運動中の筋肉の硝酸レベルの変化を含むこれらの発見は、人間でも発生することが示唆されています17。
現在の著者のうちの2人は、血液および他の液体サンプル中の硝酸塩および亜硝酸塩レベルを測定する方法を以前に確立していた18。しかし、組織ホモジネート中のこれらのアニオンのレベルが最初に分析されたとき、詳細なプロトコルは利用できませんでした。いくつかの異なる臓器における硝酸塩-亜硝酸塩-NOのダイナミクスを理解するために、私たちの目標は、骨格筋を含む哺乳類組織の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための正確で効率的な方法を開発することでした。以前の研究では、げっ歯類の組織を使用して信頼性の高い均質化プロセスを開発し、それらのホモジネート中の硝酸塩と亜硝酸塩の含有量を分析しました7,16,19。この均質化法の使用は、ヒト骨格筋生検サンプルに拡大され、それによって値が確認され、重要なことに、血液/血漿と比較して筋肉について観察された値は、げっ歯類で観察されたものと同様の範囲および比率であった17。近年、他のグループも骨格筋ホモジネート中の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定し始め、私たちのグループによって報告されたものと同等の値を報告しました20,21。
このプロトコルペーパーの目的は、硝酸塩と亜硝酸塩のレベルをその後測定するための3つの異なる均質化方法を使用した骨格筋ホモジネートの調製を詳細に説明することです。さらに、骨格筋サンプル中の硝酸塩および亜硝酸塩の値に対する均質化に使用される組織重量の影響を調べました。これらの手法は、他の種類の哺乳類組織にも容易に適用できると考えています。近年、特に運動生理学の分野では、筋肉群による硝酸塩/亜硝酸塩/NO生理機能の違いが注目されています。また、4つの異なるげっ歯類の筋肉における硝酸塩と亜硝酸塩の量を報告し、これらの異なる筋肉間で両方のイオンの不均一な分布を発見しました。さらなる研究が必要な観察。
Protocol
Representative Results
Discussion
生理学的介入の機能としてNO代謝物、硝酸塩および亜硝酸塩の変化を監視するには、代謝に重要なさまざまな臓器におけるこれらのイオンのレベルを測定することが不可欠です。血液中のヘモグロビンはNOとその代謝物と反応するため、組織サンプルからできるだけ迅速に血液を除去することも重要です。したがって、動物に生理食塩水を灌流してから骨格筋組織(臀筋、TA、EDL、腓腹筋)を収?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、学内NIH / NIDDK助成金ZIA DK 0251041-14によって、メリーランド州アランNシェクターに支援されました。
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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