Funktionelle Beurteilung der intestinalen Tight-Junction-Barriere und der Ionenpermeabilität im heimischen Gewebe durch Ussing-Chamber-Technik
Summary
Das Darmepithel verleiht nicht nur Nährstoffaufnahme, sondern auch Schutz vor schädlichen Substanzen. Die apikal-epithelste interzelluläre Verbindung, d. h. die Tight Junction, reguliert die parazelluläre Durchlässigkeit von gelösten Stoffen und Ionen. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Schleimhautblättern und zur Beurteilung der Ionenselektivität von Tight Junctions mittels Ussing-Kammertechnik beschrieben.
Abstract
Die Ussing-Kammertechnik wurde erstmals 1951 vom dänischen Wissenschaftler Hans Ussing erfunden, um den transzellulären Transport von Natrium über die Froschhaut zu untersuchen. Seitdem wurde diese Technik auf viele verschiedene Gewebe angewendet, um die physiologischen Parameter des Transports über Membranen hinweg zu untersuchen. Die Ussing-Kammermethode ist anderen Methoden vorzuziehen, da natives Gewebe verwendet werden kann, wodurch es besser auf das anwendbar ist, was in vivo geschieht. Da jedoch natives Gewebe verwendet wird, ist der Durchsatz gering, die Zeit ist begrenzt und die Gewebevorbereitung erfordert Geschick und Training. Diese Kammern wurden verwendet, um spezifische Transporterproteine in verschiedenen Geweben zu untersuchen, Krankheitspathophysiologie wie bei Mukoviszidose zu verstehen, den Transport und die Aufnahme von Medikamenten zu untersuchen und insbesondere zum Verständnis des Nährstofftransports im Darm beizutragen. Angesichts des gesamten epithelialen Transportprozesses eines Gewebes sind nicht nur transepitheliale Bahnen, sondern auch parazelluläre Wege wichtig. Tight Junctions sind eine Schlüsseldeterminante der gewebespezifischen parazellulären Permeabilität im Darm. In diesem Artikel wird die Ussing-Kammertechnik verwendet, um die parazelluläre Permselektivität von Ionen durch Messung der transepithelialen Leitfähigkeit und der Verdünnungspotentiale zu bewerten.
Introduction
Die Ussing-Kammermethode wurde erstmals von dem dänischen Wissenschaftler Hans Ussing entwickelt. Ussing verwendete es zunächst, um den Kurzschlussstrom des Natriumtransports über die Froschhaut zu messen, nachdem beobachtet wurde, dass NaCl gegen einen steilen Konzentrationsgradienten über die Haut transportiert werden konnte1. Sein System bestand aus der Froschhaut, die zwischen zwei Kammern mit Zugang zu beiden Seiten der Haut montiert war. Jede Kammer enthielt Ringer-Lösung, die zirkuliert und belüftet wurde. Zwei schmale Agar-Ringer-Brücken, die sich in der Nähe der Haut befinden und mit gesättigten KCl-Kalomel-Elektroden verbunden sind, messen die Potentialdifferenz, wie sie von einem Potentiator abgelesen wird. Ein zweites Paar Agarringerbrücken befand sich am gegenüberliegenden Ende jeder Kammer, die mit Bechergläsern mit gesättigtem KCl verbunden waren, das mit AgCl gesättigt war, um eine elektromotorische Kraft auszuüben, die von einer Batterie bereitgestellt wurde. Ein Potentialteiler wurde verwendet, um die Spannung so einzustellen, dass die Potentialdifferenz über die Haut Null blieb, wodurch Kurzschlussbedingungen erzeugt wurden. Ein Mikroamperemeter wurde ebenfalls angeschlossen, um den Strom abzulesen, der durch die Haut fließt (siehe die Abbildung in Ref.1 für das ursprüngliche Kammerdesign).
In den letzten 70 Jahren wurde diese Technik auf viele verschiedene Gewebe, insbesondere auf Darmgewebe, angewendet, um den Nährstoff- und Ionentransport zu untersuchen. Zum Beispiel wurde der Mechanismus des Cholera-induzierten Durchfalls untersucht, indem Kaninchenileum in diesen Kammern montiert wurde, und es wurde festgestellt, dass Choleratoxin-induzierter Durchfall durch cAMP2 vermittelt wird. Darüber hinaus wurden diese Kammern auch verwendet, um den Mechanismus zu untersuchen, der dem Glukosetransport über Na+-Glukose-Cotransporter 1 (SGLT1)3 zugrunde liegt. Unser Labor konzentriert sich auf den transzellulären und parazellulären Transport in Darmepithelzellen. Mit der Ussing-Kammermethode wurde der Peptidtransport in Claudin-15-Knockout-Mäusen untersucht, die den parazellulären Natriumtransport beeinträchtigt haben, wobei Ussing-Kammern verwendet wurden, um die Absorption des nicht hydrolysierbaren Dipeptids Glycylsarcosin zu messen. Es wurde festgestellt, dass die luminale Na+ -Homöostase für den Protonen-gekoppelten Peptidtransport wichtig ist4. Darüber hinaus wurden diese Kammern auch verwendet, um die Anionensekretion im murinen Blinddarm als Reaktion auf die submuköse Aktivierung des Proteinase-aktivierten Rezeptors 1 durch die Serinprotease Trypsin5 zu untersuchen.
Ussing-Kammern wurden kürzlich auch verwendet, um die parazellulären Bahnen im Epithelgewebe zu beurteilen. Parazelluläre Signalwege werden durch Tight Junctions reguliert, bei denen es sich um Proteinkomplexe handelt, die sich an dem Punkt bilden, an dem sich zwei oder mehr Zellen treffen6. Die Barrierefunktion und die Ionenselektivität (ob Anionen oder Kationen selektiv in der Lage sind, die Tight Junction zu passieren) wird durch das Vorhandensein von Proteinen der Claudin-Familie bestimmt; Einige davon wirken als Barrieren (Claudin 3 und 7), Anionenporen (Claudin 10A) oder Kationenporen (Claudin 2, 10B und 15)7. Andere Methoden wurden verwendet, um den parazellulären Signalweg zu beurteilen, wie z. B. die orale Gavage von FITC, begleitet von einer FITC-Konzentration im Blutplasma8 oder EDTA-Cr9; Diese Techniken sind jedoch von geringerer Auflösung und können die Ionenselektivität oder einen bestimmten Abschnitt der Abschnitte des Darmtraktes nicht beurteilen. Ussingkammern können jedoch verwendet werden, um das Verdünnungspotential von Zielionen zu bewerten und somit die Ionenselektivität der Dichtstellen zu bestimmen. Zum Beispiel kann mit NaCl die Selektivität der Engstellen für Na+ und Cl– berechnet werden, indem eine Seite der Membran (normalerweise die Schleimhautseite) verdünnt und die Änderung der transepithelialen Potentialdifferenz gemessen wird. Die relativen Permeabilitäten von Na+ und Cl- können durch die Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung10 und die Selektivität der Tight Junction mit der Kimizuka-Koketsu-Gleichung11 geschätzt werden. Diese Kammern haben daher den Vorteil, die elektrophysiologischen Parameter des Gewebes zu messen und liefern dadurch mehr Informationen über den Durchgang von Ionen durch die Engstellen als andere Methoden mit niedrigerer Auflösung.
Die Ussing-Kammer-Methode ist nicht nur auf den Darmtrakt beschränkt, obwohl sie in Studien über den Darm weit verbreitet ist, hat sie auch viele andere Anwendungen. Zum Beispiel wurden diese Kammern verwendet, um Mukoviszidose und insbesondere den Chloridkanal-Mukoviszidose-Transmembran-Leitwertregulator (CFTR) zu untersuchen12. Mukoviszidose wird durch eine Mutation in CFTR13 verursacht, die zu einer gestörten Chloridsekretion und einem gestörten Flüssigkeitstransport durch respiratorische Epithelzellen und einer daraus resultierenden dickeren, trockeneren Schleimschicht führt14. Die Untersuchung der epithelischen CFTR der Atemwege wurde mit diesen Kammern durchgeführt, um nicht nur die Krankheit zu verstehen, sondern auch Wege zur Behandlung der Krankheit zu finden. Zum Beispiel wurde bei Patienten mit seltenen Mutationen, die Mukoviszidose verursachen, die Analyse von respiratorischen Epithelzellen von Patienten verwendet, um Therapien wie Orkambi und eine Verstärker-Kotherapie zu testen15.
Ussing-Kammern wurden auch verwendet, um die Wege der Arzneimittelabgabe zu untersuchen, z. B. mit menschlichem Biopsiegewebe, um die Arzneimittelaufnahme und Pharmakokinetik zu untersuchen16. Die Darmaufnahme ist nicht der einzige Weg der Medikamentenabgabe. Diese Kammern wurden auch verwendet, um nasale Arzneimittelabgabesysteme zu untersuchen17. Studien zur Arzneimittelabgabe mit Ussing-Kammern wurden auch für das Auge durchgeführt. In der Hornhaut des Kaninchens wurden Permeabilitäts- und Aufnahmestudien mit Labrasol durchgeführt, einem Medikament, das die Absorption von Medikamenten über Gewebe hinweg erhöhen soll18. Eine weitere Studie untersuchte die Wirkung von Benzylalkoniumchlorid auf die transsklerale Arzneimittelabgabe im Kaninchen Sklera19.
Die Ussing-Kammermethode ist nützlich, da natives Gewebe verwendet werden kann. Als solches ist es gegenüber In-vitro-Modellen wie Caco-2-Zelllinien vorzuziehen. Die Technik erfordert jedoch Geschick und Zeit, um Proben vorzubereiten, so dass sie nicht für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet ist. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellmonoschichten können mit Hilfe von Zellkultureinsätzen in diesen Kammern untersucht werden. Jüngste Entdeckungen haben die Kultur von Organoiden ermöglicht, bei denen es sich um Mini-Organe handelt, die in Kultur aus der Ernte epithelialer oder endothelialer Stammzellen gezüchtet wurden20. Organoidkulturen können manipuliert werden, um in einer Monoschicht gezüchtet zu werden, wodurch es möglich wird, Organoide in einer Ussing-Kammer zu montieren21. Organoide verschiedener Epithel- und Endothelgewebe können untersucht werden, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere verringert wird, da die Organoidkultur langfristig aufrechterhalten werden kann. Dies erhöht auch den Durchsatz, da zeitaufwendige und mühsame Gewebedissektions- und Präparationsschritte nicht erforderlich sind. Auch in Zukunft werden die Ussing-Kammerstudien für die Untersuchung des Gewebetransports sehr nützlich sein und im Bereich der personalisierten Medizin besonders wichtig sein.
Das folgende Protokoll demonstriert die Anwendung der Ussing-Kammermethode zur Beurteilung der Permselektivität und Barrierefunktion der Tight-Junctions im Dünndarm von Claudin-15-Knockout-Mäusen (Cldn15-/-) und Wildtyp-Kontrollen (WT) durch Messung des Verdünnungspotenzials von NaCl. Tight Junctions (TJ) werden an der Stelle gebildet, an der sich zwei oder mehr Zellen im Epithel- und Endothelgewebe treffen. Es wird angenommen, dass bizelluläre Tight Junctions (bTJ), insbesondere die Proteine der Claudin-Familie, die im bTJ vorkommen, die Barrierefunktion und Permselektivität von TJ7 bestimmen. Cldn15-/– Mäuse haben einen Mega-Dünndarm22 und eine reduzierte Nährstoffaufnahmefähigkeit aufgrund des Verlustes des intestinalen Na + –Recyclings, der über Claudin 154,23,24 auftritt. Cldn15-/- Mäuse haben eine beeinträchtigte Na+-Homöostase, was sie zu einem interessanten Modell für die Untersuchung der Permselektivität des TJ macht. Das folgende Protokoll bewertet die Permeabilität des TJ gegenüber NaCl durch Messung des Verdünnungspotentials von NaCl (PNa/PCl) im mittleren Dünndarm. Kurz gesagt, die Änderung der Membranpotentialdifferenz, die durch Verdünnung einer Seite der Membran (M-Seite oder S-Seite, beide werden im folgenden Protokoll gemessen) auftritt, kann verwendet werden, um die Permeabilität von Na + (PNa) und Cl– (PCl) zu berechnen, und das Verdünnungspotential (PNa / PCl) wird zeigen, ob die Tight Junction eine kationische oder anionische Selektivität aufweist.
Die Experimente in diesem Protokoll wurden mit einer kundenspezifischen Ussing-Kammer (Abbildung 1A) durchgeführt, die aus zwei Hälften besteht, zwischen denen die Darmvorbereitung vertikal montiert ist, Spannungsklemmverstärker, elektrischer Rekorder, Elektroden, Salzbrücken, Ringer-Lösung, HEPES-Puffer (150 mM NaCl), verdünnter HEPES-Puffer (75 mM NaCl), Darmvorbereitung (für Details über die Ausrüstung siehe die Tabelle der Materialien).
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Experiment wurden Ussing-Kammern verwendet, um die elektrischen Basisparameter und das Verdünnungspotential von NaCl im Dünndarm von Cldn15-/- und WT-Mäusen zu messen. Bei der Durchführung von Ussing-Kammerexperimenten ist es sehr wichtig, zu überprüfen, ob die in den Experimenten verwendete Membranvorbereitung praktikabel ist. Dies geschieht in der Regel durch Zugabe von Glukose oder dem Adenylatcyclase-Aktivator Forskolin und durch Sehen, ob ein angemessener Anstieg des <e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von 17K00860 (zu HH) und 19K20152 (zu NI) unterstützt. WH möchte der Otsuka Toshimi Scholarship Foundation für ihre finanzielle Unterstützung von 2018-2021 danken.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
Referencias
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
