챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가
Summary
장 상피는 영양 흡수뿐만 아니라 유해 물질에 대한 보호를 제공합니다. 정점-대부분의 상피 세포간 접합, 즉 타이트한 접합은 부세포 용질 및 이온 투과성을 조절한다. 여기에서, 점막 시트의 제조 및 어싱 챔버 기술을 사용하여 타이트한 접합부의 이온 선택성의 평가를 위한 프로토콜이 기재되어 있다.
Abstract
Ussing 챔버 기술은 개구리 피부를 가로 지르는 나트륨의 세포 간 수송을 연구하기 위해 1951 년 덴마크 과학자 Hans Ussing에 의해 처음 발명되었습니다. 그 이후로,이 기술은 멤브레인을 가로 지르는 수송의 생리적 매개 변수를 연구하기 위해 많은 다른 조직에 적용되었습니다. Ussing chamber 방법은 네이티브 조직을 사용할 수 있기 때문에 다른 방법보다 바람직하므로 생체 내에서 일어나는 일에보다 적용 할 수 있습니다. 그러나 네이티브 조직이 사용되기 때문에 처리량이 낮고 시간이 제한되며 조직 준비에는 기술과 훈련이 필요합니다. 이 챔버는 다양한 조직에서 특정 수송체 단백질을 연구하고, 낭포성 섬유증과 같은 질병 병리 생리학을 이해하고, 약물 수송 및 섭취를 연구하고, 특히 장내 영양 수송에 대한 이해에 기여했습니다. 조직의 전체 상피 수송 과정을 감안할 때, 경상피 경로뿐만 아니라 부세포 경로도 중요합니다. 단단한 접합부는 장 전체에 걸친 조직 특이적 부세포 투과성의 핵심 결정 요인입니다. 이 기사에서, Ussing 챔버 기술은 경상피 전도도 및 희석 전위를 측정하여 이온의 부세포 투과성을 평가하는 데 사용됩니다.
Introduction
Ussing 챔버 방법은 덴마크 과학자 Hans Ussing에 의해 처음 개발되었습니다. Ussing은 NaCl이 가파른 농도 구배에 대해 피부를 가로 질러 수송 될 수 있다는 것을 관찰 한 후 개구리 피부를 가로 질러 나트륨 수송의 단락 전류를 측정하기 위해 처음 사용했습니다1. 그의 시스템은 피부의 양쪽에 접근 할 수있는 두 개의 챔버 사이에 장착 된 개구리 피부로 구성되었습니다. 각 챔버에는 순환되고 폭기된 링거의 용액이 들어 있었다. 피부 근처에 위치하여 포화 KCl-calomel 전극에 연결된 두 개의 좁은 한천 링거 브릿지는 포텐셔너에 의해 판독된 전위차를 측정하였다. 두 번째 한 쌍의 한천 링거 브리지는 배터리에 의해 제공되는 기전력을 인가하기 위해 AgCl로 포화된 KCl을 갖는 비커에 연결된 각 챔버의 반대쪽 끝에 위치하였다. 전위 분배기를 사용하여 전압을 조정하여 피부 전체의 전위차가 제로로 유지되어 단락 조건을 만들었습니다. 마이크로암페어 미터는 또한 피부를 통과하는 전류를 판독하기 위해 연결되었다(원래의 챔버 설계에 대해서는 ref.1 의 그림 참조).
지난 70 년 동안이 기술은 영양소와 이온 수송을 연구하기 위해 많은 다른 조직, 특히 장 조직에 적용되었습니다. 예를 들어, 콜레라-유도된 설사의 메카니즘은 이들 챔버에 토끼 장폐색을 장착함으로써 연구되었고, 콜레라 독소-유도된 설사가 cAMP2에 의해 매개된다는 것이 발견되었다. 또한, 이들 챔버는 또한 Na+-글루코스 공수송체 1 (SGLT1)3을 통한 글루코스 수송의 기초가 되는 메카니즘을 연구하는데 사용되었다. 우리 실험실은 장 상피 세포에서 세포 횡단 및 부세포 수송에 중점을 둡니다. Ussing 챔버 방법을 사용하여, 펩티드 수송을 부세포 나트륨 수송에 장애가 있는 클라우딘 15 녹아웃 마우스에서, 비가수분해성 디펩티드 글리실사르코신의 흡수를 측정하기 위해 어싱 챔버를 사용하여 평가하였다. 발광 Na+ 항상성이 양성자 결합 펩티드 수송에 중요하다는 것이 밝혀졌다4. 또한, 이들 챔버는 또한 세린 프로테아제 트립신5에 의한 프로테이나제 활성화 수용체 1의 점막하 활성화에 반응하여 뮤린 맹장에서의 음이온 분비를 조사하기 위해 사용되었다.
Ussing chambers는 또한 최근에 상피 조직에서 부세포 경로를 평가하기 위해 사용되었습니다. 부세포 경로는 두 개 이상의 세포가 만나는 지점에서 형성되는 단백질의 복합체인 타이트한 접합부에 의해 조절됩니다6. 장벽 기능 및 이온 선택성 (음이온 또는 양이온이 선택적으로 타이트 접합부를 통과 할 수 있는지 여부)은 클라우딘 패밀리 단백질의 존재에 의해 결정됩니다. 이들 중 일부는 장벽 (클로딘 3 및 7), 음이온 기공 (클로딘 10a) 또는 양이온 기공 (클로딘 2, 10b 및 15)7로 작용한다. 다른 방법들이 혈장 FITC 농도8을 수반하는 FITC의 경구 위관과 같은 부세포 경로를 평가하기 위해 사용되었다8, 또는 EDTA-Cr9; 그러나 이러한 기술은 분해능이 낮으며 이온 선택성 또는 장 부분의 특정 부분을 평가할 수 없습니다. 그러나 어싱 챔버는 표적 이온의 희석 전위를 평가하고, 따라서 타이트한 접합부의 이온 선택성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, NaCl을 사용하는 경우, Na+ 및 Cl-에 대한 타이트한 접합부의 선택성은 막의 한쪽(보통 점막측)을 희석하고 경상피 전위차의 변화를 측정함으로써 계산할 수 있다. Na+ 및 Cl-의 상대적 투과도는 Goldman-Hodgkin-Katz 방정식10에 의해 추정될 수 있으며, 타이트한 접합부의 선택성은 Kimizuka-Koketsu 방정식 11을 사용하여 추정될 수 있다. 따라서, 이들 챔버는 조직의 전기생리학적 파라미터를 측정하는 이점을 가지며, 그 결과 다른 낮은 분해능 방법보다 타이트한 접합부를 통한 이온의 통과에 대한 더 많은 정보를 제공한다.
Ussing 챔버 방법은 장에 국한 될뿐만 아니라 장에 관한 연구에서 널리 사용되지만 다른 많은 응용 프로그램도 있습니다. 예를 들어, 이들 챔버는 낭포성 섬유증, 및 구체적으로 염화물 채널 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR)12를 연구하는데 사용되어 왔다. 낭포성 섬유증은 CFTR13의 돌연변이에 의해 발생하며, 이는 호흡기 상피 세포에 의한 염화물 분비 및 유체 수송 장애를 초래하고, 결과적으로 더 두껍고 건조한 점액층14을 초래한다. 기도 상피 CFTR에 대한 연구는 질병을 이해할뿐만 아니라 질병을 치료하는 방법을 발견하기 위해이 챔버로 수행되었습니다. 예를 들어, 낭포성 섬유증을 일으키는 희귀 돌연변이를 가진 환자에서, 환자 호흡 상피 세포의 분석은 오르캄비 및 증폭기 공동요법15와 같은 치료법을 시험하는데 사용되어 왔다.
Ussing chambers는 또한 약물 섭취 및 약물 동태학을 연구하기 위해 인간 생검 조직과 같은 약물 전달 경로를 연구하는 데 사용되었습니다16. 장 흡수가 약물 전달의 유일한 경로는 아닙니다. 이들 챔버는 또한 비강 약물 전달 시스템을 연구하는데 사용되었다17. Ussing 챔버를 이용한 약물 전달 연구도 눈에 대해 수행되었습니다. 토끼 각막에서 투과성 및 흡수 연구는 조직 전반에 걸쳐 약물의 흡수를 증가시키기 위해 고안된 약물 인 Labrasol을 사용하여 수행되었습니다18. 또 다른 연구는 토끼 공막에서 경공막 약물 전달에 대한 벤질 알코늄 클로라이드의 효과를 조사했다19.
Ussing 챔버 방법은 네이티브 조직을 사용할 수 있기 때문에 유용합니다. 이와 같이, Caco-2 세포주와 같은 시험관내 모델보다 바람직하다. 그러나이 기술은 시편을 준비하는 데 기술과 시간이 필요하므로 높은 처리량 응용 분야에는 적합하지 않습니다. 세포 단일층의 전기생리학적 특성은 이들 챔버 내의 세포 배양 삽입물을 사용하여 연구될 수 있다. 최근의 발견은 상피 또는 내피 줄기 세포의 수확으로부터 배양물에서 성장한 미니 기관인 오가노이드의 배양을 허용하였다20. 오가노이드 배양은 단층에서 성장하도록 조작될 수 있고, 이로써 오가노이드를 Ussing 챔버21에 장착할 수 있게 한다. 다양한 상피 및 내피 조직의 오가노이드를 연구 할 수 있으며, 오가노이드 배양이 장기간 유지 될 수 있으므로 필요한 동물의 수를 줄입니다. 이것은 또한 시간이 많이 걸리고 힘든 조직 해부 및 준비 단계가 필요하지 않기 때문에 처리량을 증가시킵니다. 앞으로, Ussing 챔버 연구는 조직 수송을 연구하는 데 매우 유용 할 것이며 개인화 된 의학 분야에서 특히 중요 할 것입니다.
다음 프로토콜은 NaCl의 희석 전위를 측정함으로써 클라우딘 15 녹아웃 (Cldn15-/-) 마우스 및 야생형 (WT) 대조군의 소장에서 팽팽한 접합부의 permselectivity 및 장벽 기능을 평가하기 위한 어싱 챔버 방법의 적용을 입증한다. 타이트한 접합부(TJ)는 둘 이상의 세포가 상피 및 내피 조직에서 만나는 지점에서 형성된다. 이세포 타이트 접합 (bTJ), 특히 bTJ 내에서 발견되는 클라우딘 패밀리 단백질은 TJ7의 장벽 기능 및 투과성을 결정하는 것으로 생각된다. Cldn15-/- 마우스는 메가 소장22 및 클라우딘 154,23,24를 통해 발생하는 장 Na+ 재활용의 손실로 인해 감소된 영양 섭취 능력을 갖는다. Cldn15-/- 마우스는 Na+ 항상성을 손상시켰으며, 이는 TJ의 permselectivity를 연구하는 흥미로운 모델이 된다. 다음 프로토콜은 중간 소장에서 NaCl (PNa / PCl)의 희석 전위를 측정하여 NaCl에 대한 TJ의 투과성을 평가합니다. 간략하게, 멤브레인의 한쪽을 희석함으로써 발생하는 막 전위차의 변화 (M면 또는 S측, 둘 다 아래 프로토콜에서 측정됨)는 Na+ (PNa) 및 Cl–(PCl)의 투과성을 계산하는데 사용될 수 있고, 희석 전위 (PNa/PCl)는 타이트한 접합이 양이온성 또는 음이온성 선택성을 갖는지 여부를 보여줄 것이다.
이 프로토콜의 실험은 장 준비가 수직으로 장착되는 두 개의 반쪽으로 구성된 맞춤형 어싱 챔버 (그림 1A)를 사용하여 수행되었으며, 전압 클램프 증폭기, 전기 레코더, 전극, 소금 다리, 링거 용액, HEPES 버퍼 (150 mM NaCl), 희석 된 HEPES 버퍼 (75 mM NaCl), 장 준비 (장비에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 실험에서, Ussing 챔버는 Cldn15-/- 및 WT 마우스의 소장에서 NaCl의 기준선 전기 파라미터 및 희석 전위를 측정하기 위해 사용되었다. Ussing 챔버 실험을 수행 할 때 실험에 사용 된 멤브레인 준비가 실행 가능한지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 일반적으로 포도당 또는 아데닐레이트 사이클라제 활성화제 포스콜린을 첨가하고 Isc (마우스에서 100-300 μA / cm2</…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 17K00860(HH로) 및 19K20152(NI로)에서 지원됩니다. WH는 오츠카 도시미 장학금 재단이 2018-2021 년의 재정 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
Referencias
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
