Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique
Summary
Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.
Abstract
La principale cause de décès dans le monde persiste sous forme de maladies cardiovasculaires (MCV). Cependant, la modélisation de la complexité physiologique et biologique du muscle cardiaque, le myocarde, est notoirement difficile à accomplir in vitro. Principalement, les obstacles résident dans le besoin de cardiomyocytes humains (MC) qui sont adultes ou présentent des phénotypes de type adulte et peuvent reproduire avec succès la complexité cellulaire du myocarde et l’architecture 3D complexe. Malheureusement, en raison de préoccupations éthiques et du manque de tissu cardiaque humain primaire dérivé du patient disponible, combinés à la prolifération minimale des MC, l’approvisionnement en MC humaines viables a été une étape limitative pour l’ingénierie des tissus cardiaques. À cette fin, la plupart des recherches ont fait la transition vers la différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSTH) comme source principale de MC humaines, ce qui a entraîné l’incorporation à grande échelle de HIPSC-MC dans les essais in vitro pour la modélisation des tissus cardiaques.
Ici, dans ce travail, nous démontrons un protocole pour le développement d’un tissu cardiaque humain dérivé de cellules souches matures 3D dans un dispositif microfluidique. Nous expliquons spécifiquement et démontrons visuellement la production d’un modèle 3D anisotrope de tissu cardiaque sur puce anisotrope à partir de MC dérivés de hiPSC. Nous décrivons principalement un protocole de purification pour sélectionner pour les MC, la co-culture de cellules avec un rapport défini par l’intermédiaire du mélange des MC avec des FC humains (hFC), et la suspension de cette co-culture dans l’hydrogel à base de collagène. Nous démontrons en outre l’injection de l’hydrogel chargé de cellules dans notre dispositif microfluidique bien défini, intégré avec des micropostes elliptiques décalés qui servent de topographie de surface pour induire un degré élevé d’alignement des cellules environnantes et de la matrice d’hydrogel, imitant l’architecture du myocarde natif. Nous envisageons que le modèle de tissu sur puce cardiaque anisotrope 3D proposé convient aux études de biologie fondamentale, à la modélisation des maladies et, grâce à son utilisation comme outil de dépistage, aux tests pharmaceutiques.
Introduction
Les approches d’ingénierie tissulaire ont été largement explorées, ces dernières années, pour accompagner les résultats cliniques in vivo en médecine régénérative et en modélisation des maladies1,2. Un accent significatif a été particulièrement mis sur la modélisation in vitro des tissus cardiaques en raison des difficultés inhérentes à l’approvisionnement en tissu cardiaque primaire humain et à la production de substituts in vitro physiologiquement pertinents, limitant la compréhension fondamentale des mécanismes complexes des maladies cardiovasculaires (MCV)1,3. Les modèles traditionnels ont souvent impliqué des tests de culture monocouche 2D. Cependant, l’importance de la culture de cellules cardiaques dans un environnement 3D pour imiter à la fois le paysage natif du myocarde et les interactions cellulaires complexes a été largement caractérisée4,5. De plus, la plupart des modèles produits jusqu’à présent ont inclus une monoculture de MC différenciées des cellules souches. Cependant, le cœur est composé de plusieurs types de cellules6 au sein d’une architecture 3D complexe7,justifiant le besoin critique d’améliorer la complexité de la composition tissulaire au sein des modèles in vitro 3D pour mieux imiter les constituants cellulaires du myocarde natif.
À ce jour, de nombreuses approches différentes ont été explorées pour produire des modèles 3D biomimétiques du myocarde8. Ces approches vont des configurations expérimentales qui permettent le calcul en temps réel de la force générée, des MC mono-culture ensemencés sur des films minces (réputés films minces musculaires (MTF))9,à la co-culture de cellules cardiaques dans des matrices d’hydrogel 3D suspendues parmi des cantilevers autoportants (tissus cardiaques réputés modifiés (EHTs))10. D’autres approches se sont concentrées sur la mise en œuvre de techniques de micromoldage pour imiter l’anisotropie myocardique, des MC mono-culture dans un hydrogel 3D suspendu parmi des micropostes saillants dans une parcelle tissulaire11,aux MC mono-culture ensemencées parmi des microgrooves dentelés12,13. Il y a des avantages et des inconvénients inhérents à chacune de ces méthodes, par conséquent, il est pertinent d’utiliser la technique qui s’aligne sur l’application prévue et la question biologique correspondante.
La capacité d’améliorer la maturation des MC dérivés des cellules souches est essentielle pour l’ingénierie in vitro réussie du tissu myocardique de type adulte et la traduction des résultats suivants en interprétations cliniques. À cette fin, les méthodes de maturation des MC ont été largement explorées, tant en 2D qu’en 3D14,15,16. Par exemple, la stimulation électrique incorporée dans les EHTs, l’alignement forcé des MC avec la topographie de surface, les signaux, les facteurs de croissance de la co-culture et/ou les conditions d’hydrogel 3D, etc., conduisent tous à un changement en faveur de la maturation cm dans au moins l’un des éléments suivants: morphologie cellulaire, manipulation du calcium, structure sarcomérique, expression génique ou force contractile.
Parmi ces modèles, les approches qui utilisent des plateformes microfluidiques conservent certains avantages dans la nature, tels que le contrôle des gradients, l’entrée limitée des cellules et les réactifs minimaux nécessaires. En outre, de nombreuses répétitions biologiques peuvent être générées à la fois à l’aide de plates-formes microfluidiques, servant à mieux disséquer le mécanisme biologique d’intérêt et à augmenter la taille expérimentale de l’échantillon en faveur de la puissance statistique17,18,19. De plus, l’utilisation de la photolithographie dans le processus de fabrication de dispositifs microfluidiques permet la création de caractéristiques précises (p. ex., topographies) aux niveaux micro et nanométrique, qui servent de repères mésoscopiques pour améliorer la structure cellulaire environnante et l’architecture tissulaire au niveau macro18,20,21, 22 pour différentes applications dans la régénération tissulaire et la modélisation des maladies.
Nous avons précédemment démontré le développement d’un nouveau modèle 3D de tissu cardiaque sur puce qui intègre la topographie de surface, sous la forme de micropostes elliptiques innés, pour aligner les cellules cardiaques co-cultivées encapsulées par hydrogel dans un tissu anisotrope interconnecté20. Après 14 jours de culture, les tissus formés dans le dispositif microfluidique sont plus matures dans leur phénotype, leur profil d’expression génique, leurs caractéristiques de manipulation du calcium et leur réponse pharmaceutique par rapport aux contrôles monocouches et isotropes 3D23. Le protocole décrit ici décrit la méthode de création de ce tissu cardiaque humain co-cultivé et aligné (c.-à-d. anisotrope) 3D dans le dispositif microfluidique utilisant des MC dérivés de hiPSC. Plus précisément, nous expliquons les méthodes pour différencier et purifier les HIPSCs vers les MC, la supplémentation des hCF avec des MC pour produire une population établie de co-culture, l’insertion de la population cellulaire encapsulée dans l’hydrogel de collagène dans les dispositifs microfluidiques, et l’analyse ultérieure des tissus construits en 3D par des essais contractiles et immunofluorescentscents. Les micro-tissus 3D qui en résultent conviennent à diverses applications, y compris les études de biologie fondamentale, la modélisation CVD et les tests pharmaceutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formation d’un modèle de tissu cardiaque humain in vitro avec des interactions cellule-cellule améliorées et une structure 3D biomimétique est impérative pour la recherche cardiovasculaire fondamentale et les applications cliniques correspondantes1. Ce protocole décrit explique le développement du tissu cardiaque anisotrope humain 3D dans un dispositif microfluidique, utilisant la co-culture des MC dérivés de cellules souches avec des FC conjonctifs encapsulés dans un hydro…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le NSF CAREER Award #1653193, arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872), et le Flinn Foundation Award pour avoir fourni des sources de financement pour ce projet. La ligne hiPSC, SCVI20, a été obtenue de Joseph C. Wu, MD, PhD au Stanford Cardiovascular Institute financé par NIH R24 HL117756. La ligne hiPSC, IMR90-4, a été obtenue auprès du WiCell Research Institute55,56.
Materials
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
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