Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Abstract

Die weltweit häufigste Todesursache bleibt herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Modellierung der physiologischen und biologischen Komplexität des Herzmuskels, des Myokards, ist jedoch notorisch schwierig in vitro zu erreichen. Hindernisse liegen hauptsächlich in der Notwendigkeit menschlicher Kardiomyozyten (CMs), die entweder erwachsen sind oder erwachsene Phänotypen aufweisen und die zelluläre Komplexität und komplizierte 3D-Architektur des Myokards erfolgreich replizieren können. Leider war aufgrund ethischer Bedenken und des Mangels an primärem, vom Patienten abgeleitetem menschlichem Herzgewebe in Kombination mit der minimalen Proliferation von CMs die Beschaffung lebensfähiger menschlicher CMs ein limitierender Schritt für das Herzgewebe-Engineering. Zu diesem Zweck hat sich die meiste Forschung in Richtung kardialer Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) als primäre Quelle menschlicher CMs entwickelt, was zu einer breiten Einbeziehung von hiPSC-CMs in In-vitro-Assays für die Kardiengewebemodellierung führte.

Hier in dieser Arbeit demonstrieren wir ein Protokoll zur Entwicklung eines 3D-reifen Stammzell-abgeleiteten menschlichen Herzgewebes in einem mikrofluidischen Gerät. Wir erklären und demonstrieren insbesondere die Herstellung eines 3D-in-vitro-anisotropen Herzgewebe-on-a-Chip-Modells aus hiPSC-abgeleiteten CMs. Wir beschreiben in erster Linie ein Reinigungsprotokoll zur Auswahl für CMs, die Co-Kultur von Zellen mit einem definierten Verhältnis durch Mischen von CMs mit menschlichen CFs (hCFs) und die Suspension dieser Co-Kultur innerhalb des kollagenbasierten Hydrogels. Wir demonstrieren außerdem die Injektion des zellbeladenen Hydrogels in unser gut definiertes mikrofluidisches Gerät, eingebettet in versetzte elliptische Mikropfosten, die als Oberflächentopographie dienen, um ein hohes Maß an Ausrichtung der umgebenden Zellen und der Hydrogelmatrix zu induzieren und die Architektur des nativen Myokards nachzuahmen. Wir stellen uns vor, dass das vorgeschlagene anisotrope 3D-Kardiengewebe-on-Chip-Modell für grundlegende biologische Studien, Krankheitsmodellierung und durch seine Verwendung als Screening-Tool für pharmazeutische Tests geeignet ist.

Introduction

Tissue Engineering-Ansätze wurden in den letzten Jahren umfassend erforscht, um klinische In-vivo-Befunde in der regenerativen Medizin und Krankheitsmodellierung zu begleiten^1,2. Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten bei der Beschaffung von humanem primärem Herzgewebe und der Herstellung physiologisch relevanter In-vitro-Surrogate wurde insbesondere der In-vitro-Kardgewebemodellierung besondere Bedeutung beigemischt, was das grundlegende Verständnis der komplexen Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) einschränkt^1,3. Traditionelle Modelle haben oft 2D-Monolayer-Kultur-Assays beinhaltet. Die Bedeutung der Kultivierung von Herzzellen in einer 3D-Umgebung, um sowohl die native Landschaft des Myokards als auch komplexe zelluläre Interaktionen nachzuahmen, wurde jedoch ausführlich charakterisiert^4,5. Darüber hinaus enthielten die meisten bisher hergestellten Modelle eine Monokultur von CMs, die von Stammzellen differenziert wurden. Das Herz besteht jedoch aus mehreren Zelltypen⁶ innerhalb einer komplexen 3D-Architektur^7,was die kritische Notwendigkeit rechtfertigt, die Komplexität der Gewebezusammensetzung in 3D-In-vitro-Modellen zu verbessern, um zelluläre Bestandteile des nativen Myokards besser nachzuahmen.

Bis heute wurden viele verschiedene Ansätze erforscht, um biomimetische 3D-Modelle des Myokards⁸zu erstellen. Diese Ansätze reichen von experimentellen Setups, die die Echtzeitberechnung der erzeugten Kraft ermöglichen, von Monokultur-CMs, die auf dünnen Filmen gesät sind (als muskulöse dünne Schichten (MTFs))^9,bis hin zu Co-Kultur-Herzzellen in 3D-Hydrogelmatrizen, die zwischen freistehenden Auslegern schweben (als künstliche Herzgewebe (EHTs))¹⁰. Andere Ansätze haben sich auf die Implementierung von Mikroformtechniken konzentriert, um die myokardiale Anisotropie nachzuahmen, von Monokultur-CMs in einem 3D-Hydrogel, das zwischen hervorstehenden Mikropfosten in einem Gewebepflaster¹¹suspendiert ist, bis hin zu Monokultur-CMs, die zwischen eingerückten Mikrorillen gesät sind^12,13. Es gibt inhärente Vor- und Nachteile für jede dieser Methoden, daher ist es wichtig, die Technik zu verwenden, die mit der beabsichtigten Anwendung und der entsprechenden biologischen Frage übereinstimmt.

Die Fähigkeit, die Reifung von aus Stammzellen gewonnenen CMs zu verbessern, ist für das erfolgreiche In-vitro-Engineering von adultem Myokardgewebe und die Translation der nachfolgenden Befunde in klinische Interpretationen unerlässlich. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Reifung von CMs umfassend erforscht, sowohl in 2D als auch in 3D^14,15,16. Zum Beispiel führen elektrische Stimulation, die in EHTs integriert ist, erzwungene Ausrichtung von CMs mit der Oberflächentopographie, Signalsignale, Wachstumsfaktoren aus Co-Kultur und / oder 3D-Hydrogelbedingungen usw. zu einer Veränderung zugunsten der CM-Reifung in mindestens einer der folgenden: Zellmorphologie, Kalziumhandhabung, Sarkomerikstruktur, Genexpression oder kontraktile Kraft.

Von diesen Modellen behalten die Ansätze, die mikrofluidische Plattformen verwenden, bestimmte Vorteile in der Natur, wie die Kontrolle von Gradienten, begrenzten Zelleintrag und minimal notwendige Reagenzien. Darüber hinaus können viele biologische Replikate auf einmal mit mikrofluidischen Plattformen erzeugt werden, die dazu dienen, den biologischen Mechanismus von Interesse besser zu sezieren und die experimentelle Stichprobengröße zugunsten der statistischen Leistung zu erhöhen^17,18,19. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung der Photolithographie im mikrofluidischen Geräteherstellungsprozess die Erstellung präziser Merkmale (z. B. Topographien) auf Mikro- und Nanoebene, die als mesoskopische Hinweise zur Verbesserung der umgebenden Zellstruktur und der Gewebearchitektur auf Makroebene dienen^18,20 ,^21,22 für verschiedene Anwendungen in der Geweberegeneration und Krankheitsmodellierung.

Wir haben bereits die Entwicklung eines neuartigen 3D-Herzgewebe-On-Chip-Modells demonstriert, das Oberflächentopographie in Form von angeborenen elliptischen Mikropfosten enthält, um hydrogelverkapselte co-kultivierte Herzzellen in ein miteinander verbundenes, anisotropes Gewebe auszurichten²⁰. Nach 14 Tagen Kultur sind die im mikrofluidischen Gerät gebildeten Gewebe im Vergleich zu Monoschicht- und 3D-isotropen Kontrollen reifer in ihrem Phänotyp, Genexpressionsprofil, Kalziumhandhabungseigenschaften und pharmazeutischen^{Reaktionen 23}. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Methode zur Herstellung dieses 3D-kokultivierten, ausgerichteten (d.h. anisotropen) menschlichen Herzgewebes innerhalb des mikrofluidischen Geräts unter Verwendung von hiPSC-abgeleiteten CMs. Insbesondere erläutern wir die Methoden zur Differenzierung und Reinigung von hiPSCs in Richtung CMs, die Supplementierung von hCFs mit CMs zur Erzeugung einer etablierten Co-Kulturpopulation, das Einfügen der im Kollagenhydrogel verkapselten Zellpopulation in die mikrofluidischen Geräte und die anschließende Analyse der 3D-konstruierten Gewebe durch kontraktile und immunfluoreszierende Assays. Die resultierenden 3D-Mikrogewebe eignen sich für verschiedene Anwendungen, einschließlich grundlegender biologischer Studien, CVD-Modellierung und pharmazeutischer Tests.

Protocol

Führen Sie die gesamte Zellhandhabung und Reagenzienvorbereitung in einer Biosicherheitswerkbank durch. Stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen, Materialien und Geräte, die mit Zellen in Kontakt kommen, steril sind (d. h. mit 70% Ethanol besprühen). Die Zellen sollten in einem befeuchteten 37 °C, 5% CO2 Inkubator kultiviert werden. Die gesamte hiPSC-Kultur und -Differenzierung erfolgt in 6-Well-Platten. 1. Erstellung mikrofluidischer Geräte (ungefähre Dauer: 1 Woche) …

Representative Results

Um eine hochgereinigte Population von CMs aus hiPSCs zu erhalten, wird eine modifizierte Version verwendet, die eine Kombination aus dem Lian-Differenzierungsprotokoll33 und den Tohyama-Reinigungsschritten34 beinhaltet (siehe Abbildung 1A für den experimentellen Zeitplan). Die hiPSCs müssen kolonieartig sein, ~85% konfluent und gleichmäßig in der Kultur gut 3-4 Tage nach der Passage zu Beginn der CM-Differenzierung verteilt sein (<strong cl…

Discussion

Die Bildung eines in vitro humanen Herzgewebemodells mit verbesserten Zell-Zell-Interaktionen und biomimetischer 3D-Struktur ist für die kardiovaskuläre Grundlagenforschung und entsprechende klinische Anwendungen unerlässlich¹. Dieses skizzierte Protokoll erklärt die Entwicklung von 3D-humanem anisotropem Herzgewebe in einem mikrofluidischen Gerät unter Verwendung der Co-Kultur von Stammzell-abgeleiteten CMs mit verbindenden CFs, die in einem Kollagenhydrogel verkapselt sind, um die …

Materials

0.65 mL centrifuge tubes	VWR	87003-290
1 mm Biopsy punch	VWR	95039-090
1.5 mm Biopsy punch	VWR	95039-088
15 mL Falcon tubes	VWR	89039-670
18x18mm coverslips	VWR	16004-308	The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates	VWR	82050-844
B27 minus insulin	LifeTech	A1895602
B27 plus insulin	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Collagen I, rat tail	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	can also be made in house
EDTA	VWR	45001-122
Ethanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycine	Sigma	G8898-500G
Goat serum	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Pen/Strep	VWR	15140122
Petri dish (150x15mm)	VWR	25384-326
Petri dish (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenol Red	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose	VWR	45001-110
Silicon Wafers (100mm)	University Wafer	1196
Sodium lactate	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Developer	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 flasks	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 Aligner	EVG
Plasma cleaner PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope	Nikon
Leica SP8 Confocal microscope	Leica