Usando o sequenciamento da próxima geração para identificar mutações associadas ao reparo de uma quebra de fio dupla induzida pelo CAS9 perto do promotor cd4
Summary
Apresentado aqui é o endonuclease sgRNA/CAS9 e o protocolo de sequenciamento de próxima geração que pode ser usado para identificar as mutações associadas ao reparo de quebra de fios duplos perto do promotor CD4.
Abstract
Quebras duplas de fios (DSBs) no DNA são o tipo mais citotóxico de dano de DNA. Como uma miríade de insultos pode resultar nessas lesões (por exemplo, estresse de replicação, radiação ionizante, dano UV não reparado), os DSBs ocorrem na maioria das células todos os dias. Além da morte celular, DSBs não reparados reduzem a integridade do genoma e as mutações resultantes podem impulsionar a tumorigênese. Esses riscos e a prevalência de DSBs motivam investigações sobre os mecanismos pelos quais as células reparam essas lesões. O sequenciamento da próxima geração pode ser emparelhado com a indução de DSBs por radiação ionizante para fornecer uma ferramenta poderosa para definir precisamente as mutações associadas aos defeitos de reparo do DSB. No entanto, essa abordagem requer sequenciamento de genoma inteiro e proibitivo de custos computacionalmente para detectar o reparo dos DSBs que ocorrem aleatoriamente associados à radiação ionizante. Endonucleases de corte raros, como o I-Sce1, fornecem a capacidade de gerar um único DSB, mas seus locais de reconhecimento devem ser inseridos no genoma do interesse. Como resultado, o local de reparo é inerentemente artificial. Os avanços recentes permitem orientar o RNA (sgRNA) a direcionar uma endonuclease Cas9 para qualquer lócus de genoma de interesse. Isso poderia ser aplicado ao estudo do reparo do DSB tornando o sequenciamento da próxima geração mais econômico, permitindo que ele se concentrasse no DNA flanqueando o DSB induzido pelo Cas9. O objetivo do manuscrito é demonstrar a viabilidade dessa abordagem apresentando um protocolo que pode definir mutações que decorrem da reparação de um DSB upstream do gene CD4. O protocolo pode ser adaptado para determinar mudanças no potencial mutagênico do DSB associados a fatores exógenos, como inibidores de reparação, expressão de proteína viral, mutações e exposições ambientais com requisitos de computação relativamente limitados. Uma vez que o genoma de um organismo tenha sido sequenciado, este método pode ser teoricamente empregado em qualquer lócus genômico e em qualquer modelo de cultura celular desse organismo que pode ser transfeminado. Adaptações semelhantes da abordagem poderiam permitir comparações de fidelidade de reparo entre diferentes loci no mesmo fundo genético.
Introduction
Manter a estabilidade genômica é fundamental para todos os organismos vivos. A replicação precisa do DNA e uma resposta robusta de dano de DNA (DDR) são necessárias para propagar fielmente o material genético 1,2. Os danos no DNA ocorrem regularmente na maioria das células 2,3. Quando esses danos são sentidos, a progressão do ciclo celular é interrompida, e os mecanismos de reparação do DNA são ativados. Quebras duplas de fios no DNA ou DSBs são o tipo mais tóxico e mutagênico de dano de DNA 3,4.
Embora várias vias de sinalização DDR possam reparar essas lesões, as vias de reparo DSB mais estudadas são a recombinação homologous (RH) e a junção final não homóloga (NHEJ). O RH é um caminho em grande parte livre de erros que repara um DSB usando um cromátide irmã como modelo homólogo. Isso tende a acontecer na fase S e G2 de um ciclocelular 5,6,7. O NHEJ é mais propenso a erros, mas pode acontecer ao longo do ciclocelular 8,9. Vários ensaios de repórteres foram desenvolvidos para medir a eficiência de mecanismos específicos de reparo 10,11,12. Esses ensaios tendem a depender da citometria de fluxo para uma medição de alto rendimento da atividade da via de reparo DSB usando GFP ou mCherry como leitura11,13. Embora altamente eficientes, eles dependem de reparos canônicos que ocorrem em um DSB artificialmente introduzido.
Há uma variedade de outros métodos usados para estudar o reparo do DSB. Muitos deles dependem da microscopia de imunofluorescência (IF) 1,14. Se a microscopia detectar focos nucleares discretos representativos de complexos de reparo após os DSBs serem induzidos pela exposição a produtos químicos genotoxicos ou radiação ionizante15,16. O acompanhamento da formação e resolução desses focos fornece uma indicação de iniciação e conclusão do reparo, respectivamente14,17. No entanto, esses métodos de indução de DSB (ou seja, produtos químicos ou radiação ionizante) não causam DSBs em locais definidos no genoma. Também é funcionalmente impossível usá-los para induzir consistentemente apenas um pequeno número (por exemplo, 2-4) de DSBs. Como resultado, os métodos mais comumente utilizados de induzir DSBs causam uma infinidade de lesões distribuídas aleatoriamente ao longo do genoma18. Um pequeno número de DSBs pode ser introduzido inserindo o local de reconhecimento de uma endonuclease de corte raro e expressando a endonuclease pertinente, como o I-Sce119. Infelizmente, a necessária integração de um local de destino impede o exame de DSB em loci genômico endógeno.
Este manuscrito descreve um método para detectar mutações associadas ao reparo de um DSB gerado em um lócus definido pelo usuário. Fornecemos um exemplo representativo da abordagem aplicada para avaliar a capacidade de uma proteína viral de aumentar o número de mutações associadas a um DSB. Especificamente, este manuscrito descreve o uso de um único guia RNA (sgRNA) para direcionar uma endonuclease CAS9 para induzir um DSB no quadro de leitura aberta CD4 humano em queratinócitos de prepúcio humano expressando controle vetorial (HFK LXSN) e HFK que expressa a proteína E6 do vírus papiloma humano tipo 8 (HFK 8E6). O sequenciamento de última geração (NGS) da região em torno do rompimento permite que mutações associadas à reparação da lesão sejam rigorosamente definidas. Esses dados demonstram que a proteína viral causa um aumento de aproximadamente 20 vezes nas mutações durante o reparo do DSB. Também fornece uma caracterização imparcial das consequências mutagênicas dos DSBs em um único lócus sem a necessidade de sequenciamento de genoma inteiro. Em princípio, o protocolo poderia ser facilmente adaptado para comparar o risco relativo de mutações entre loci genoma ou linhas celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Além da profundidade das informações fornecidas, existem várias vantagens para este método. Primeiro, o reparo do DSB, em teoria, pode ser avaliado em qualquer loci genômico sem modificar o genoma da célula de interesse. Em segundo lugar, o acesso à análise de reparo do NGS é aumentado pelo custo reduzido e pelo esforço computacional proporcionado pela fabricação e análise de um único DSB direcionado a uma área definida. Finalmente, com os genomas de organismos adicionais se tornando rotineiramente dispon…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (P20GM130448) (NAW e RP); Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde (NCI R15 CA242057 01A1); Centro de Pesquisa do Câncer Johnson na Universidade Estadual do Kansas; e o Departamento de Defesa dos EUA (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Agradecemos a KSU-CVM Confocal Core e Joel Sanneman pela nossa microscopia de imunofluorescência. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dessas agências de financiamento.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
Referencias
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