Uso de la secuenciación de próxima generación para identificar mutaciones asociadas con la reparación de una rotura de doble cadena inducida por CAS9 cerca del promotor CD4
Summary
Aquí se presenta la endonucleasa sgRNA / CAS9 y el protocolo de secuenciación de próxima generación que se puede utilizar para identificar las mutaciones asociadas con la reparación de rotura de doble cadena cerca del promotor CD4.
Abstract
Las roturas de doble cadena (DSB) en el ADN son el tipo más citotóxico de daño en el ADN. Debido a que una miríada de insultos pueden resultar en estas lesiones (por ejemplo, estrés de replicación, radiación ionizante, daño UV no reparado), los DSB ocurren en la mayoría de las células cada día. Además de la muerte celular, los DSB no reparados reducen la integridad del genoma y las mutaciones resultantes pueden impulsar la tumorigénesis. Estos riesgos y la prevalencia de los DSB motivan las investigaciones sobre los mecanismos por los cuales las células reparan estas lesiones. La secuenciación de próxima generación se puede combinar con la inducción de DSB mediante radiación ionizante para proporcionar una herramienta poderosa para definir con precisión las mutaciones asociadas con los defectos de reparación de DSB. Sin embargo, este enfoque requiere una secuenciación del genoma completo computacionalmente desafiante y prohibitiva para detectar la reparación de los DSB que ocurren al azar asociados con la radiación ionizante. Las endonucleasas de corte raras, como I-Sce1, proporcionan la capacidad de generar un solo DSB, pero sus sitios de reconocimiento deben insertarse en el genoma de interés. Como resultado, el sitio de reparación es inherentemente artificial. Los avances recientes permiten que el ARN guía (sgRNA) dirija una endonucleasa Cas9 a cualquier locus del genoma de interés. Esto podría aplicarse al estudio de la reparación del DSB, lo que hace que la secuenciación de próxima generación sea más rentable al permitir que se centre en el ADN que flanquea el DSB inducido por Cas9. El objetivo del manuscrito es demostrar la viabilidad de este enfoque mediante la presentación de un protocolo que puede definir mutaciones que se derivan de la reparación de un DSB aguas arriba del gen CD4. El protocolo se puede adaptar para determinar los cambios en el potencial mutagénico del DSB asociados con factores exógenos, como inhibidores de la reparación, expresión de proteínas virales, mutaciones y exposiciones ambientales con requisitos de cálculo relativamente limitados. Una vez que el genoma de un organismo ha sido secuenciado, este método puede ser empleado teóricamente en cualquier locus genómico y en cualquier modelo de cultivo celular de ese organismo que pueda ser transfectado. Adaptaciones similares del enfoque podrían permitir comparaciones de la fidelidad de reparación entre diferentes loci en el mismo fondo genético.
Introduction
Mantener la estabilidad genómica es fundamental para todos los organismos vivos. La replicación precisa del ADN y una respuesta robusta al daño del ADN (DDR) son necesarias para propagar fielmente el material genético 1,2. Los daños en el ADN ocurren regularmente en la mayoría de las células 2,3. Cuando se detectan estos daños, se detiene la progresión del ciclo celular y se activan los mecanismos de reparación del ADN. Las roturas de doble cadena en el ADN o DSB son el tipo de daño al ADN más tóxico y mutagénico 3,4.
Si bien varias vías de señalización DDR pueden reparar estas lesiones, las vías de reparación de DSB más estudiadas son la recombinación homóloga (HR) y la unión final no homóloga (NHEJ). HR es una vía en gran parte libre de errores que repara un DSB utilizando una cromátida hermana como plantilla homóloga. Esto tiende a suceder en la fase S y la fase G2 de un ciclo celular 5,6,7. NHEJ es más propenso a errores, pero puede ocurrir a lo largo del ciclo celular 8,9. Se han desarrollado varios ensayos de reporteros para medir la eficiencia de mecanismos de reparación específicos 10,11,12. Estos ensayos tienden a basarse en la citometría de flujo para una medición de alto rendimiento de la actividad de la vía de reparación de DSB utilizando GFP o mCherry como lectura11,13. Si bien son altamente eficientes, se basan en la reparación canónica que ocurre en un DSB introducido artificialmente.
Hay una variedad de otros métodos utilizados para estudiar la reparación de DSB. Muchos de estos se basan en la microscopía de inmunofluorescencia (IF) 1,14. La microscopía IF detecta focos nucleares discretos representativos de complejos de reparación después de que los DSB son inducidos por la exposición a productos químicos genotóxicos o radiaciones ionizantes15,16. El seguimiento de la formación y resolución de estos focos proporciona una indicación del inicio y la finalización de la reparación, respectivamente14,17. Sin embargo, estos métodos de inducción de DSB (es decir, productos químicos o radiación ionizante) no causan DSB en lugares definidos en el genoma. También es funcionalmente imposible usarlos para inducir consistentemente solo un pequeño número (por ejemplo, 2-4) de DSB. Como resultado, los métodos más utilizados para inducir DSB causan una multitud de lesiones distribuidas aleatoriamente por todo el genoma18. Se puede introducir un pequeño número de DSB insertando el sitio de reconocimiento para una endonucleasa de corte raro y expresando la endonucleasa pertinente, como I-Sce119. Desafortunadamente, la integración requerida de un sitio objetivo impide el examen de DSB en loci genómicos endógenos.
Este manuscrito describe un método para detectar mutaciones asociadas con la reparación de un DSB generado en un locus definido por el usuario. Proporcionamos un ejemplo representativo del enfoque aplicado para evaluar la capacidad de una proteína viral para aumentar el número de mutaciones asociadas con un DSB. Específicamente, este manuscrito describe el uso de un ARN guía único (sgRNA) para dirigir una endonucleasa CAS9 para inducir un DSB en el marco de lectura abierto CD4 humano en queratinocitos del prepucio humano que expresan control vectorial (HFK LXSN) y HFK que expresa la proteína E6 del virus del papiloma humano tipo 8 (HFK 8E6). La secuenciación dirigida de próxima generación (NGS) de la región que rodea la ruptura permite definir rigurosamente las mutaciones asociadas con la reparación de la lesión. Estos datos demuestran que la proteína viral causa un aumento de aproximadamente 20 veces en las mutaciones durante la reparación del DSB. También proporciona una caracterización imparcial de las consecuencias mutagénicas de los DSB en un solo locus sin la necesidad de secuenciar el genoma completo. En principio, el protocolo podría adaptarse fácilmente para comparar el riesgo relativo de mutaciones entre loci del genoma o líneas celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Además de la profundidad de la información proporcionada, hay varias ventajas de este método. En primer lugar, la reparación de DSB, en teoría, se puede evaluar en cualquier loci genómico sin modificar el genoma de la célula de interés. En segundo lugar, el acceso al análisis ngsano de la reparación se ve incrementado por la reducción del costo y el esfuerzo computacional que ofrece la creación y el análisis de un único OSD dirigido a una zona definida. Finalmente, con los genomas de organismos adicionales …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (P20GM130448) (NAW y RP); Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud (NCI R15 CA242057 01A1); Centro de Investigación del Cáncer Johnson en la Universidad Estatal de Kansas; y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Agradecemos a KSU-CVM Confocal Core y a Joel Sanneman por nuestra microscopía de inmunofluorescencia. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de estas agencias de financiación.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
Referencias
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