Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3
Summary
Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle des iMC via un flux de calcium (Ca2+).
Abstract
La reprogrammation cardiaque est devenue une thérapie potentiellement prometteuse pour réparer un cœur endommagé. En introduisant plusieurs facteurs de transcription, y compris Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en cardiomyocytes induits (iCM). Ces iMC, lorsqu’ils sont générés in situ dans un cœur infarctus, s’intègrent électriquement et mécaniquement au myocarde environnant, entraînant une réduction de la taille des cicatrices et une amélioration de la fonction cardiaque. En raison de l’efficacité, de la pureté et de la qualité relativement faibles de la reprogrammation des iMC, la caractérisation des iMC reste un défi. Les méthodes actuellement utilisées dans ce domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR, se concentrent principalement sur l’expression des gènes et des protéines spécifiques au cœur, mais pas sur la maturation fonctionnelle des iCM. Déclenchée par des potentiels d’action, l’ouverture de canaux calciques voltage-dépendants dans les cardiomyocytes entraîne un afflux rapide de calcium dans la cellule. Par conséquent, quantifier le taux d’afflux de calcium est une méthode prometteuse pour évaluer la fonction cardiomyocytaire. Ici, le protocole introduit une méthode pour évaluer la fonction iCM par flux de calcium (Ca2+). Une souche de souris αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a été établie en croisant des souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (appelée Myh6-Cre ci-dessous) avec des souris Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelées Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous). Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) de souris néonatales P0-P2 ont été isolés et cultivés in vitro, et une construction polycistronique de MGT a été introduite dans les NCF, ce qui a conduit à leur reprogrammation en iCM. Étant donné que seuls les iCM reprogrammés avec succès exprimeront le rapporteur GCaMP3, la maturation fonctionnelle des iCM peut être évaluée visuellement par flux Ca2+ avec microscopie à fluorescence. Par rapport aux NCF non reprogrammés, les NCF-iCM ont montré un flux transitoire de calcium significatif et une contraction spontanée, similaires aux CM. Ce protocole décrit en détail l’établissement de la souche de souris, l’isolement et la sélection des cœurs de souris néonatales, l’isolement NCF, la production de rétrovirus pour la reprogrammation cardiaque, l’induction iCM, l’évaluation du flux iCM Ca2+ à l’aide de notre ligne de rapporteurs, ainsi que l’analyse statistique et la présentation des données connexes. On s’attend à ce que les méthodes décrites ici fournissent une plate-forme précieuse pour évaluer la maturation fonctionnelle des iCM pour les études de reprogrammation cardiaque.
Introduction
L’infarctus du myocarde (IM) est une maladie grave dans le monde entier. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde et représentent environ 18,6 millions de décès en 20191,2. La mortalité totale des MCV a diminué au cours du dernier demi-siècle. Cependant, cette tendance a été ralentie, voire inversée, dans certains pays sous-développés1, ce qui nécessite des traitements plus efficaces des MCV. En tant que l’une des manifestations mortelles des MCV, l’IM représente environ la moitié de tous les décès attribués aux MCV aux États-Unis2. Au cours de l’ischémie, avec le blocage des artères coronaires et un apport limité en nutriments et en oxygène, le myocarde subit de graves changements métaboliques, altère la fonction systolique des cardiomyocytes (CM) et entraîne la mort de cm3. De nombreuses approches dans la recherche cardiovasculaire ont été explorées pour réparer les lésions cardiaques et restaurer la fonction du cœur blessé4. La reprogrammation cardiaque directe est apparue comme une stratégie prometteuse pour réparer le cœur endommagé et restaurer sa fonction5,6. En introduisant Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en iCM in vitro et in vivo, et ces iCM peuvent réduire la zone cicatricielle et améliorer la fonction cardiaque7,8.
Bien que la reprogrammation cardiaque soit une stratégie prometteuse pour le traitement de l’IM, il reste un certain nombre de défis. Tout d’abord, l’efficacité, la pureté et la qualité de la reprogrammation ne sont pas toujours aussi élevées que prévu. L’incitation MGT ne peut atteindre que 8,4 % (cTnT+) ou 24,7 % (αMHC-GFP+) du total des FC à reprogrammer en iCM in vitro7, ou jusqu’à 35 % de vivo8, ce qui limite son application. Même avec plus de facteurs induits dans le système, tels que Hand29 ou Akt1 / PKB10, l’efficacité de la reprogrammation est encore à peine satisfaisante pour être utilisée en milieu clinique. Ainsi, d’autres études axées sur l’amélioration de l’efficacité de la reprogrammation sont nécessaires dans ce domaine. Deuxièmement, les caractéristiques d’intégrité électrique et de contraction des iCM sont importantes pour l’amélioration efficace de la fonction cardiaque, mais elles sont difficiles à évaluer. Actuellement, les méthodes d’évaluation largement utilisées dans le domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR de l’expression de certains gènes clés des MC, sont toutes axées sur la similitude des iCM et des MC, mais ne sont pas directement liées aux caractéristiques fonctionnelles des iCM. En outre, ces méthodes ont des procédures relativement compliquées et prennent beaucoup de temps. Alors que les études de reprogrammation impliquent généralement un dépistage des facteurs de reprogrammation potentiels qui favorisent la maturation des iCM11, la reprogrammation cardiaque nécessite une méthode rapide et pratique basée sur la fonction iCM.
Les CM ouvrent les canaux ioniques calcium voltage-dépendants sur la cytomembrane au cours de chaque cycle de contraction, ce qui conduit à un afflux transitoire d’ions calcium (Ca2+) du liquide intercellulaire vers le cytoplasme pour participer à la contraction du myofilament. Un tel cycle d’afflux et d’outflux de Ca2+ est le trait fondamental de la contraction myocardique et constitue la fonction normale des CM12. Ainsi, une méthode qui détecte l’afflux de Ca2+ pourrait être un moyen potentiel de mesurer la fonction des CM et des cellules de type CM, y compris les iCM. De plus, pour les iCM, une telle méthode offre un autre moyen d’évaluer l’efficacité de la reprogrammation.
Des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI) ont été développés et largement utilisés pour indiquer les activités cellulaires, en particulier les potentiels d’action. Généralement, les GECI se composent d’un domaine de liaison Ca2+ tel que la calmoduline, et d’un domaine fluorescent tel que GFP, et GCaMP3 est un domaine avec une affinité et une intensité de fluorescence élevées. Le domaine de fluorescence de GCaMP3 sera activé lorsque la concentration locale de calcium est modifiée13. Dans cet article, une souche de souris qui exprime spécifiquement un rapporteur GCaMP3 dans les cellules Myh6+ est décrite. En introduisant le MGT dans les NCF isolés des nouveau-nés de cette souche, la reprogrammation peut être surveillée par fluorescence, que les iCM reprogrammés avec succès présenteront. Une telle souche de souris et une telle méthode fourniront une plate-forme précieuse pour étudier la reprogrammation cardiaque.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’évaluation de la fonction iCM est nécessaire pour le domaine de la reprogrammation cardiaque. Dans ce manuscrit, le protocole décrit une souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J qui a été établie, comment utiliser les NCF isolés des souris néonatales dans cette souche pour la reprogrammation en iCM, et l’évaluation de la fonction iCM par flux Ca2+ . Il s’agit d’une méthode de novo pour évaluer la maturation fonctionnelle des iMC.
<p cl…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions les efforts de Leo Gnatovskiy dans l’édition du texte anglais de ce manuscrit. La figure 1 a été créée avec BioRender.com. Cette étude a été soutenue par la subvention des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (1R01HL109054) au Dr Wang.
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
Referencias
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