Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter
Summary
Descriviamo qui, l’istituzione e l’applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell’efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale degli iCM tramite il flusso di calcio (Ca2+).
Abstract
La riprogrammazione cardiaca è diventata una terapia potenzialmente promettente per riparare un cuore danneggiato. Introducendo più fattori di trascrizione, tra cui Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in cardiomiociti indotti (iCM). Questi iCM, quando generati in situ in un cuore infartuato, si integrano elettricamente e meccanicamente con il miocardio circostante, portando ad una riduzione delle dimensioni della cicatrice e ad un miglioramento della funzione cardiaca. A causa dell’efficienza, della purezza e della qualità relativamente basse della riprogrammazione degli iCM, la caratterizzazione degli iCM rimane una sfida. I metodi attualmente utilizzati in questo campo, tra cui la citometria a flusso, l’immunocitochimica e la qPCR, si concentrano principalmente sull’espressione di geni e proteine cardiaco-specifici, ma non sulla maturazione funzionale degli iCM. Innescata dai potenziali d’azione, l’apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti nei cardiomiociti porta ad un rapido afflusso di calcio nella cellula. Pertanto, quantificare il tasso di afflusso di calcio è un metodo promettente per valutare la funzione dei cardiomiociti. Qui, il protocollo introduce un metodo per valutare la funzione iCM in base al flusso di calcio (Ca2+). Un ceppo di topo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 è stato stabilito incrociando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (indicato come Myh6-Cre di seguito) con topi Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (indicato come Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito). I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) di topi neonatali P0-P2 sono stati isolati e coltivati in vitro e una costruzione policistronica di MGT è stata introdotta negli NCF, che ha portato alla loro riprogrammazione in iCM. Poiché solo gli iCM riprogrammati con successo esprimeranno il reporter GCaMP3, la maturazione funzionale degli iCM può essere valutata visivamente dal flusso Di Ca2+ con microscopia a fluorescenza. Rispetto agli NCF non riprogrammati, gli NCF-iCM hanno mostrato un flusso transitorio di calcio significativo e una contrazione spontanea, simili ai CM. Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione del ceppo murino, l’isolamento e la selezione dei cuori dei topi neonatali, l’isolamento NCF, la produzione di retrovirus per la riprogrammazione cardiaca, l’induzione iCM, la valutazione del flusso di iCM Ca2 + utilizzando la nostra linea reporter e la relativa analisi statistica e presentazione dei dati. Si prevede che i metodi qui descritti forniranno una preziosa piattaforma per valutare la maturazione funzionale degli iCM per gli studi di riprogrammazione cardiaca.
Introduction
L’infarto miocardico (MI) è una malattia grave in tutto il mondo. Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo e rappresentano circa 18,6 milioni di decessi nel 20191,2. La mortalità totale delle CVD è diminuita nell’ultimo mezzo secolo. Tuttavia, questa tendenza è stata rallentata o addirittura invertita in alcuni paesi non sviluppati1, il che richiede trattamenti più efficaci delle CVD. Come una delle manifestazioni fatali di CVD, MI rappresenta circa la metà di tutti i decessi attribuiti a CVD negli Stati Uniti2. Durante l’ischemia, con il blocco delle arterie coronarie e l’apporto limitato di nutrienti e ossigeno, il miocardio subisce gravi cambiamenti metabolici, compromette la funzione sistolica dei cardiomiociti (CM) e porta alla morte del CM3. Numerosi approcci nella ricerca cardiovascolare sono stati esplorati per riparare le lesioni cardiache e ripristinare la funzione del cuore ferito4. La riprogrammazione cardiaca diretta è emersa come una strategia promettente per riparare il cuore danneggiato e ripristinarne la funzione5,6. Con l’introduzione di Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in iCM in vitro e in vivo, e questi iCM possono ridurre l’area cicatriziale e migliorare la funzione cardiaca7,8.
Sebbene la riprogrammazione cardiaca sia una strategia promettente per il trattamento dell’infarto miocardico, rimangono una serie di sfide. In primo luogo, l’efficienza, la purezza e la qualità della riprogrammazione non sono sempre così alte come previsto. L’incentivo MGT può raggiungere solo l’8,4% (cTnT+) o il 24,7% (αMHC-GFP+) del totale dei CF da riprogrammare in iCM in vitro7, o fino al 35% de vivo8, il che ne limita l’applicazione. Anche con più fattori indotti nel sistema, come Hand29 o Akt1 / PKB10, l’efficienza di riprogrammazione è ancora appena soddisfacente per essere utilizzata in un ambiente clinico. Pertanto, sono necessari ulteriori studi incentrati sul miglioramento dell’efficienza di riprogrammazione in questo campo. In secondo luogo, l’integrità elettrica e le caratteristiche di contrazione degli iCM sono importanti per il miglioramento efficiente della funzione cardiaca, ma sono difficili da valutare. Attualmente, i metodi di valutazione ampiamente utilizzati nel campo, tra cui la citometria a flusso, l’immunocitochimica e la qPCR di alcuni importanti cv di espressione dei geni, sono tutti focalizzati sulla somiglianza di iCM e CM, ma non direttamente correlati alle caratteristiche funzionali degli iCM. Inoltre, tali metodi hanno procedure relativamente complicate e richiedono molto tempo. Mentre gli studi di riprogrammazione di solito comportano uno screening dei potenziali fattori di riprogrammazione che promuovono la maturazione degli iCM11, la riprogrammazione cardiaca richiede un metodo rapido e conveniente basato sulla funzione degli iCM.
I CM aprono i canali ionici del calcio voltaggio-dipendenti sulla citomembrana durante ogni ciclo di contrazione, il che porta ad un afflusso transitorio di ioni calcio (Ca2+) dal fluido intercellulare al citoplasma per partecipare alla contrazione del miofilamento. Tale ciclo di afflusso e deflusso di Ca2+ è il tratto fondamentale della contrazione miocardica e costituisce la normale funzione delle CM12. Pertanto, un metodo che rileva l’afflusso di Ca2+ potrebbe essere un modo potenziale per misurare la funzione delle CM e delle celle simili a CM, compresi gli iCM. Inoltre, per gli iCM, tale metodo fornisce un altro modo per valutare l’efficienza della riprogrammazione.
Indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per indicare le attività cellulari, in particolare i potenziali d’azione. Generalmente, i GECI sono costituiti da un dominio di legame Ca2+ come la calmodulina e da un dominio fluorescente come GFP, e GCaMP3 è uno con alta intensità di affinità e fluorescenza. Il dominio di fluorescenza di GCaMP3 verrà attivato quando la concentrazione locale di calcio viene modificata13. In questo articolo, viene descritto un ceppo di topo che esprime specificamente un reporter GCaMP3 in cellule Myh6+. Introducendo MGT nei NCF isolati dai neonati di questo ceppo, la riprogrammazione può essere monitorata mediante fluorescenza, che esporrà con successo iCM riprogrammati. Un tale ceppo e metodo di topo fornirà una preziosa piattaforma per studiare la riprogrammazione cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
La valutazione della funzione degli iCM è necessaria per il campo della riprogrammazione cardiaca. In questo manoscritto, il protocollo descrive un ceppo di topo Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J che è stato stabilito, come utilizzare gli NCF isolati dai topi neonatali in questo ceppo per la riprogrammazione in iCM e la valutazione della funzione degli iCM mediante flusso di Ca2 +. Questo è un metodo de novo per valutare la maturazione funzionale degli iCM.
<p cl…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo gli sforzi di Leo Gnatovskiy nella redazione del testo inglese di questo manoscritto. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti (1R01HL109054) sovvenzione al Dr. Wang.
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
Referencias
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