JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

Dit protocol beschrijft een nieuwe rAAV-gebaseerde transient enhancer-reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om enhancer-gedreven expressie in vivo in het muizenbrein te induceren.

Abstract

Versterkers zijn bindingsplatforms voor een breed scala aan transcriptiefactoren die specifieke expressiepatronen van weefsel- en celtypespecifieke genen aansturen. Meerdere middelen om niet-coderend DNA en verschillende chromatinetoestanden te beoordelen, zijn nuttig gebleken bij het voorspellen van de aanwezigheid van enhancersequenties in het genoom, maar het valideren van de activiteit van deze sequenties en het vinden van de organen en ontwikkelingsstadia waarin ze actief zijn, is een arbeidsintensief proces. Recente ontwikkelingen in adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren hebben de wijdverspreide levering van transgenen aan muizenweefsels mogelijk gemaakt, waardoor in vivo versterkertests mogelijk zijn zonder dat een transgeen dier nodig is. Dit protocol laat zien hoe een reporterconstructie die EGFP uitdrukt onder controle van een minimale promotor, die op zichzelf geen significante expressie aandrijft, kan worden gebruikt om de activiteitspatronen van kandidaat-versterkersequenties in het muizenbrein te bestuderen. Een AAV-verpakte reporterconstructie wordt afgeleverd bij de hersenen van de muis en gedurende 1-4 weken geïncubeerd, waarna het dier wordt geofferd en hersensecties onder een microscoop worden waargenomen. EGFP verschijnt in cellen waarin de geteste versterker voldoende is om genexpressie te initiëren, waarbij de locatie en het ontwikkelingsstadium waarin de versterker actief is in de hersenen wordt bepaald. Standaard kloonmethoden, goedkope AAV-verpakkingen en uitbreidende AAV-serotypen en -methoden voor in vivo levering en standaard beeldvormingsuitlezing maken dit een toegankelijke benadering voor de studie van hoe genexpressie in de hersenen wordt gereguleerd.

Introduction

Versterkers zijn genomische cis-regulerende elementen die dienen als transcriptiefactorbindingsplaatsen en de expressie van een doelgen op een spatiotemporaal specifieke manier kunnen stimuleren 1,2. Ze zijn differentieel actief in verschillende celtypen, weefsels en ontwikkelingsstadia en kunnen substraten zijn van ziekterisicogerelateerde genomische variatie 3,4. De noodzaak om de dynamiek van de enhancer-functie te begrijpen is dus van cruciaal belang voor vooruitgang in zowel translationele als fundamentele wetenschappelijke toepassingen binnen genomica. In silico kunnen voorspellingen van enhancer-activiteit dienen als uitstekende bronnen voor het genereren van hypothesen als voor enhancer-capaciteit 5,6. Een dergelijke voorspelde enhancer-activiteit kan aanvullende validatie en ondervraging vereisen voor een volledig begrip van de functionele activiteit. Enhancer reporter assays zijn waardevol gebleken voor dit doel in verschillende systemen, van cellen tot dieren 7,8,9. Om deze studies uit te breiden in een flexibele en kosteneffectieve voorbijgaande in vivo context, beschrijft dit protocol het gebruik van in vivo AAV-gebaseerde methoden om vermeende enhancersequenties te testen op hun vermogen om de expressie van een ectopisch reportergen in het postnatale muizenbrein te stimuleren. Deze familie van methoden heeft nut voor het ondervragen van enkele kandidaatsequenties of parallelle bibliotheekscreening en is relevant voor fundamenteel en translationeel onderzoek.

Deze methode combineert in een enkel plasmide een vermeende versterker kandidaat-DNA-sequentie met een reporter-gen (hier EGFP), onder de controle van een minimale promotor die alleen geen significante expressie stimuleert. Het plasmide wordt verpakt in recombinant AAV (rAAV) en geïnjecteerd in een diermodel. Hoewel de toepassing hier op de hersenen is, maken verschillende rAAV-serotypen infectie in verschillende weefseltypen mogelijk, zodat deze aanpak kan worden uitgebreid naar andere systemen10. Na verloop van tijd kunnen de hersenen worden verzameld en getest op de expressie van het reporter-gen. Sterke expressie, vergeleken met controles, geeft aan dat de geteste kandidaatsequentie in staat was om de expressie van het gen te “verbeteren” (figuur 1). Dit eenvoudige ontwerp biedt een eenvoudige en duidelijke aanpak om een reeks te testen op versterkeractiviteit in vivo in de hersenen.

Naast het testen op het vermogen van een versterker van een sequentie, kan deze methode worden gecombineerd met technieken om de activiteit van het celtype versterker te bepalen. In sequentiegebaseerde benaderingen voor het bepalen van differentiële versterkeractiviteit, kan het sorteren van cellen op celtypespecifieke markers voorafgaand aan DNA- en RNA-sequencing onderzoekers in staat stellen om te bepalen of verschillende celtypen differentiële versterkeractiviteit vertonen, zoals werd beschreven in Gisselbrecht et al.11. In op beeldvorming gebaseerde benaderingen maakt co-labeling van afbeeldingen met celtypespecifieke markers het mogelijk om te onderzoeken of cellen met enhancer-gedreven fluorescentie ook celtypemarkers van belang weergeven 12,13,14,15,16. Enhancer reporter assays maken directe testen van risico-geassocieerde allelische variatie in versterkers mogelijk op effecten op het vermogen van enhancers. De overgrote meerderheid van de risicoloci die in genoombrede associatiestudies (GWAS) zijn geïdentificeerd, ligt in niet-coderende regio’s van het genoom17. Functionele annotatiestudies van deze risicoloci geven aan dat een groot deel waarschijnlijk fungeert als versterkers 18,19,20. MPRA-implementatie in vivo kan het testen van deze risico-geassocieerde varianten voor versterkeractiviteit in de hersenen mogelijk maken12,21. Tot slot kan levering en afhaling op verschillende tijdstippen inzicht bieden in de ontwikkelingsfasen waarin een versterker actief is.

Enhancer-reporter plasmide ontwerpen zijn divers en kunnen worden aangepast aan experimentele doelen. Er zijn verschillende opties voor minimale promotors die zijn gebruikt in versterkeronderzoek, zoals de humane β-globine minimale promotor22 en de muis Hsp68 minimal promoter23. Van deze promotors is bekend dat ze lage expressieniveaus stimuleren, tenzij ze worden gekoppeld aan een enhancer-element om ze te activeren. Constitutieve promotorelementen daarentegen stimuleren een sterke expressie van het transgen, nuttig voor positieve controle of om te testen op enhancer-functie tegen een achtergrond van robuuste expressie. Veel voorkomende keuzes voor constitutieve promotors zijn CAG, een hybride promotor afgeleid van de kip β-actine promotor en de cytomegalovirus onmiddellijk-vroege versterker24, of humaan EF1α25. Aangezien van versterkers bekend is dat ze bidirectioneel werken26, zijn de oriëntatie en locatie van de versterker ten opzichte van de minimale promotor flexibel (figuur 2A). Traditionele enhancer-reporter assays plaatsen de enhancer stroomopwaarts van de promotor en omvatten in bibliotheekleveringen een barcodesequentie stroomafwaarts van het reporter-gen om sequencing reads te associëren met de geteste enhancer27. Versterkers kunnen echter ook in het open leesframe van het reporter-gen worden geplaatst en dienen als hun eigen barcodesequentie, zoals wordt gedaan in STARR-seq28. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van het STARR-seq-testontwerp, waarbij de kandidaat-enhancersequentie in de 3 ‘UTR van het reporter-gen wordt geplaatst. Hoewel de STARR-seq-oriëntatie het voordeel biedt van meer gestroomlijnd klonen, is het minder goed begrepen dan de conventionele benadering en kan het variabele RNA-stabiliteit tussen constructen induceren. De beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast aan de STARR-seq of conventionele oriëntatie met kleine wijzigingen in het kloonproces die elders zijn beschreven27,29.

Verschillende methoden voor AAV-levering kunnen worden gebruikt om deze techniek verder aan te passen aan experimentele doelen (figuur 2B). Directe intracraniale injecties, verder beschreven in dit protocol, leveren een hoge concentratie virus rechtstreeks aan de hersenen30. Dit geeft een hoge transductie-efficiëntie gecentreerd op de injectieplaats, waardoor dit een uitstekende techniek is voor experimenten die de dichtheid van getransduceerde cellen over een weefselgebied willen maximaliseren. Stereotactische injectie kan helpen bij het standaardiseren van de injectieplaats bij dieren voor reproduceerbare gelokaliseerde transductie. Intracraniale injecties zijn het eenvoudigst bij vroege postnatale dieren. Als alternatieve techniek kunnen systemische injecties transgenen afleveren met behulp van AAV’s met serotypen die de bloed-hersenbarrière kunnen passeren31. Staartaderinjecties laten het virus door het lichaam circuleren, waardoor gegeneraliseerde afgifte over veel weefsels mogelijk wordt10. Retro-orbitale injecties zijn een andere systemische injectietechniek die het virus achter het oog afgeeft in de retro-orbitale sinus32. Dit biedt een directere route voor de AAV van het veneuze systeem naar de hersenen, wat resulteert in een hogere concentratie van getransduceerde cellen in de hersenen dan injecties in meer perifere bloedvaten33.

Een ander flexibel aspect van deze techniek is de methode van uitlezing. In grote lijnen kunnen opties worden beschreven als reporter-based of sequencing-based (figuur 2C). Het opnemen van een fluorescerende reporter zoals GFP in het open leesframe van het construct resulteert in de expressie van het fluorescerende eiwit in alle getransduceerde cellen waar de kandidaat-versterker expressie aandreef. Etiketterings- en beeldvormingstechnieken zoals immunohistochemie maken signaalversterking mogelijk. Sequencing-gebaseerde uitleestechnieken omvatten het identificeren van sequenties van het geleverde construct in RNA verzameld uit het weefsel. Door de hoeveelheid viraal DNA te kwantificeren die aanvankelijk werd afgeleverd, kan de vergelijking van uitgedrukt RNA versus afgeleverd DNA worden gebruikt om de mate te bepalen waarin een geteste versterkersequentie in staat was om verhoogde expressie van het transgen te stimuleren, bijvoorbeeld in de context van een massaal parallelle reporter assay (MPRA). MPRA’s bieden een krachtige uitbreiding van deze technieken om tot duizenden kandidaat-versterkers tegelijkertijd op activiteit te testen en zijn uitgebreid beschreven in genomics-onderzoek 12,27,34,35,36. Screening met een hogere doorvoer wordt bereikt door het uitvoeren van kloon-, verpakkings-, leverings- en sequencingstappen voor kandidaat-versterkers in batch in plaats van individueel.

De selectie van kandidatenversterkers biedt een andere mogelijkheid voor flexibiliteit (figuur 2D). Deze test kan bijvoorbeeld worden gebruikt om versterkers van een specifiek gen te identificeren, om de functie van niet-coderende DNA-regio’s van belang vast te stellen, of om specifieke celtypen of ontwikkelingsstadia te bepalen waarin een versterker actief is – die allemaal doelen dienen, zowel in de basiswetenschap als in ziekteonderzoek. Over het algemeen wordt de selectie van kandidaat-versterkers aangedreven door in silico-voorspellingen van versterkeractiviteit. Gewoonlijk omvatten in silico-voorspellingen ChIP-seq voor histonmodificaties die wijzen op waarschijnlijke versterkers, zoals H3K27ac37 en chromatine accessibility mapping38. Ten slotte is een groeiend onderzoeksgebied de functiegebaseerde screening van synthetisch ontworpen enhancer-elementen, waardoor studies mogelijk worden gemaakt van hoe enhancer-sequentie functie39 stuurt en het ontwerp van enhancers met specifieke eigenschappen40.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #22339) en de UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Dit protocol is getest op C57BL/6J muizen van beide geslachten op postnatale dag 0-1. 1. Kloon de enhancer kandidaat-sequentie in het AAV-vectorplasmide. OPMERKING: De representatieve protocollen worden gegeven, maar de kloonstrategie heeft een hoge mate van flexibiliteit. …

Representative Results

Met behulp van deze methoden werd een 915 bp-sequentie in het psychiatrische risico-geassocieerde derde intron van het gen CACNA1C 19,49,50 getest op versterkeractiviteit in de postnatale muizenhersenen. Deze sequentie werd ontdekt in een MPRA van 345 kandidaat-enhancersequenties gericht op psychiatrische en neurologische risico-SNP’s12 en karakteriseringsexperimenten worden hier beschreven als e…

Discussion

Dit protocol beschrijft een op rAAV gebaseerde methode voor de inzet van enhancer-gedreven transgenen in het postnatale muizenbrein. In dit gegeneraliseerde protocol worden een kandidaat-versterker, een minimale promotor, een reporter-gen en een optionele barcodesequentie gekloond in een AAV-plasmide-ruggengraat. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd met een enkele kandidaat-enhancersequentie of met veel sequenties parallel. Het plasmide wordt verpakt in een rAAV en afgeleverd bij de postnatale muizenhersenen. Na ee…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sequencing werd uitgevoerd in de UC Davis DNA Technologies Core. We bedanken het lab van Lin Tian bij UC Davis voor de training over rAAV-verpakkingen en het genereus schenken van AAV-helper en rep / cap-plasmiden. Dit werk werd ondersteund door NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

AAVEnhancerExpressionReporterConstructCloningPCRGibson CloningPlasmidVirus TiterIn VivoMouse Brain

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image