פריסת AAV של מבני ביטוי מבוססי משפר in vivo במוח עכבר
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה חדשנית של משפר-כתב ארעי המבוססת על rAAV. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לגרום לביטוי המונע על ידי משפר in vivo במוח העכבר.
Abstract
משפרים הם פלטפורמות קשירה למגוון רחב של גורמי שעתוק המניעים דפוסי ביטוי ספציפיים של גנים ספציפיים לרקמות ולתאים. אמצעים מרובים להערכת דנ”א שאינו מקודד ומצבי כרומטין שונים הוכחו כיעילים בניבוי נוכחותם של רצפי משפרים בגנום, אך אימות הפעילות של רצפים אלה ומציאת האיברים ושלבי ההתפתחות שבהם הם פעילים הוא תהליך עתיר עבודה. ההתקדמות האחרונה בווקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) אפשרה העברה נרחבת של טרנסגנים לרקמות עכבר, מה שאפשר בדיקות משפר in vivo מבלי להזדקק לבעל חיים מהונדס. פרוטוקול זה מראה כיצד מבנה כתב המבטא EGFP תחת שליטתו של מקדם מינימלי, שאינו מניע ביטוי משמעותי בפני עצמו, יכול לשמש כדי לחקור את דפוסי הפעילות של רצפי משפר מועמדים במוח העכבר. מבנה כתב ארוז AAV מועבר למוח העכבר ודוגר במשך 1-4 שבועות, ולאחר מכן החיה מוקרבה, וקטעי מוח נצפים תחת מיקרוסקופ. EGFP מופיע בתאים שבהם המשפר הנבדק מספיק כדי ליזום ביטוי גנים, תוך ציון המיקום והשלב ההתפתחותי שבו המשפר פעיל במוח. שיטות שיבוט סטנדרטיות, אריזות AAV בעלות נמוכה והרחבת הסרוטיפים והשיטות של AAV להעברת in vivo וקריאת הדמיה סטנדרטית הופכים גישה זו לגישה נגישה לחקר האופן שבו ביטוי גנים מווסת במוח.
Introduction
משפרים הם אלמנטים גנומיים של ויסות ציס-רגולטורי המשמשים כאתרי קשירה של גורמי שעתוק ויכולים להניע את הביטוי של גן מטרה באופן ספציפי מרחבית 1,2. הם פעילים באופן דיפרנציאלי בסוגי תאים, רקמות ושלבי התפתחות שונים ויכולים להיות מצעים של וריאציה גנומית הקשורה לסיכון למחלות 3,4. לפיכך, הצורך להבין את הדינמיקה של תפקוד המשפר הוא קריטי להתקדמות הן ביישומים תרגומיים והן ביישומים מדעיים בסיסיים בגנומיקה. בסיליקו תחזיות של פעילות משפר יכולות לשמש משאבים מצוינים ליצירת השערות לגבי יכולת שיפור 5,6. פעילות משפרת חזויה כזו יכולה לדרוש תיקוף וחקירה נוספים להבנה מלאה של הפעילות התפקודית. מבחני כתבים משפרים הוכיחו את עצמם כבעלי ערך למטרה זו במגוון מערכות, מתאים ועד בעלי חיים 7,8,9. לקראת הרחבת מחקרים אלה בהקשר גמיש וחסכוני של in vivo, פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיטות מבוססות in vivo AAV לבדיקת רצפי משפר פוטטיביים על יכולתם להניע את הביטוי של גן מדווח חוץ רחמי במוח העכבר שלאחר הלידה. למשפחה זו של שיטות יש תועלת בחקירת רצפי מועמדים בודדים או סינון ספרייה מקביל והיא רלוונטית למחקר בסיסי ותרגומי.
שיטה זו משלבת בפלסמיד יחיד רצף דנ”א מועמד לשיפור פוטטיבי עם גן מדווח (כאן EGFP), תחת שליטתו של מקדם מינימלי שאינו מניע ביטוי משמעותי. הפלסמיד נארז לתוך AAV רקומביננטי (rAAV) ומוזרק למודל של בעלי חיים. בעוד היישום כאן הוא על המוח, סרוטיפים שונים של rAAV מאפשרים זיהום על פני סוגי רקמות שונים, כך שניתן להרחיב גישה זו למערכות אחרות10. לאחר פרק זמן מסוים, ניתן לאסוף את המוח ולבדוק את הביטוי של הגן המדווח. ביטוי חזק, בהשוואה לבקרות, מצביע על כך שרצף המועמדים שנבדקו הצליח “לשפר” את ביטוי הגן (איור 1). עיצוב פשוט זה מציע גישה קלה וברורה לבדיקת רצף של פעילות משפרת in vivo במוח.
בנוסף לבדיקת יכולת השיפור של רצף, ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות לקביעת פעילות משפר מסוג תא. בגישות מבוססות רצף לקביעת פעילות משפרת דיפרנציאלית, מיון תאים על סמנים ספציפיים לסוג התא לפני ריצוף דנ”א ורנ”א יכול לאפשר לחוקרים לקבוע אם סוגי תאים שונים מראים פעילות משפרת דיפרנציאלית, כפי שתואר ב- Gisselbrecht et al.11. בגישות מבוססות הדמיה, תיוג משותף של תמונות עם סמנים ספציפיים לסוג תא מאפשר לבחון אם תאים המציגים פלואורסצנציה מונעת משפר מציגים גם סמנים מסוג תא בעלי עניין 12,13,14,15,16. מבחני כתב משפר מאפשרים בדיקה ישירה של שונות אלילית הקשורה לסיכון במשפרים להשפעות על יכולת המשפר. הרוב המכריע של מוקדי הסיכון שזוהו במחקרי אסוציאציה כלל-גנומית (GWAS) נמצאים באזורים שאינם מקודדים בגנום17. מחקרי ביאור פונקציונליים של מוקדי סיכון אלה מצביעים על כך שחלק גדול ככל הנראה פועלים כמשפרים18,19,20. פריסת MPRA in vivo יכולה לאפשר בדיקה של גרסאות אלה הקשורות לסיכון לפעילות משפרת במוח12,21. לבסוף, משלוח ואיסוף בנקודות זמן שונות יכולים להציע תובנות לגבי השלבים ההתפתחותיים שבמהלכם פעיל המשפר.
עיצובי פלסמידים משפרים-כתבים הם מגוונים וניתן להתאים אותם אישית כך שיתאימו למטרות הניסוי. ישנן מספר אפשרויות עבור מקדמים מינימליים ששימשו במחקר משפר, כגון מקדם מינימלי β-גלובין אנושי22 ועכבר Hsp68 מקדם מינימלי23. מקדמים אלה ידועים כמניעים רמות נמוכות של ביטוי, אלא אם כן הם משולבים עם אלמנט משפר כדי להפעיל אותם. לעומת זאת, אלמנטים מקדימים מכוננים מניעים ביטוי חזק של הטרנסגן, שימושי לשליטה חיובית או לבדיקת תפקוד משפר על רקע ביטוי חזק. אפשרויות נפוצות עבור מקדמים מכוננים כוללות CAG, מקדם היברידי המופק ממקדם β-אקטין עוף ומשפר ציטומגלווירוסמיידי 24, או EF1α25 אנושי. מאחר שידוע שמשפרים פועלים באופן דו-כיווני26, הכיוון והמיקום של המשפר ביחס למקדם המינימלי הם גמישים (איור 2A). מבחני משפר-כתב מסורתיים ממקמים את המשפר במעלה הזרם של המקדם, ובמשלוחי ספרייה, כוללים רצף ברקוד במורד הזרם של הגן המדווח כדי לשייך קריאות ריצוף עם המשפרהנבדק 27. עם זאת, משפרים יכולים גם להיות ממוקמים במסגרת הקריאה הפתוחה של הגן המדווח ולשמש כרצף ברקוד משלהם, כפי שנעשה ב- STARR-seq28. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתכנון הבדיקה STARR-seq, ומכניס את רצף משפר המועמדים לתוך 3′ UTR של הגן המדווח. בעוד שהאוריינטציה STARR-seq מציעה את היתרון של שיבוט יעיל יותר, היא פחות מובנת מהגישה הקונבנציונלית ועשויה לגרום ליציבות RNA משתנה בין מבנים. ניתן להתאים בקלות את השיטות המתוארות לכיוון STARR-seq או קונבנציונלי עם שינויים קלים בתהליך השיבוט שתוארו במקום אחר27,29.
ניתן להשתמש בשיטות שונות של אספקת AAV כדי להתאים אישית עוד יותר את הטכניקה הזו כך שתתאים למטרות הניסוי (איור 2B). זריקות תוך גולגולתיות ישירות, המתוארות בהרחבה בפרוטוקול זה, מספקות ריכוז גבוה של הנגיף ישירות למוח30. זה נותן יעילות התמרה גבוהה המרוכזת באתר ההזרקה, מה שהופך את זה לטכניקה מצוינת לניסויים המבקשים למקסם את הצפיפות של תאים מתמרים על פני אזור של רקמה. הזרקה סטריאוטקטית יכולה לעזור לתקנן את אתר ההזרקה על פני בעלי חיים לצורך התמרה מקומית הניתנת לשחזור. זריקות תוך גולגולתיות הן הפשוטות ביותר בבעלי חיים מוקדמים לאחר הלידה. כטכניקה חלופית, זריקות סיסטמיות יכולות להעביר טרנסגנים באמצעות AAVs עם סרוטיפים המסוגלים לחצות את מחסום הדם-מוח31. זריקות לווריד הזנב מאפשרות לנגיף להסתובב בכל הגוף, ומאפשרות העברה כללית על פני רקמות רבות10. זריקות רטרו-אורביטליות הן טכניקת הזרקה מערכתית נוספת המעבירה את הנגיף מאחורי העין לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי32. זה מציע מסלול ישיר יותר עבור AAV מהמערכת הוורידית למוח, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה יותר של תאים מתמרים במוח מאשר זריקות לתוך כלי דם היקפיים יותר33.
היבט גמיש נוסף של טכניקה זו הוא שיטת הקריאה. באופן כללי, ניתן לתאר אפשרויות כמבוססות דיווח או מבוססות רצף (איור 2C). שילוב כתב פלואורסצנטי כגון GFP במסגרת הקריאה הפתוחה של המבנה מביא לביטוי של החלבון הפלואורסצנטי בכל התאים המתמרים שבהם המשפר המועמד הניע ביטוי. טכניקות תיוג והדמיה כגון אימונוהיסטוכימיה מאפשרות הגברת אותות. טכניקות קריאה מבוססות ריצוף כוללות זיהוי רצפים מהמבנה המועבר ב-RNA שנאסף מהרקמה. על ידי כימות כמות הדנ”א הנגיפי שנמסר בתחילה, ניתן להשתמש בהשוואה של רנ”א מבוטא לעומת דנ”א מועבר כדי לקבוע את המידה שבה רצף משפר שנבדק היה מסוגל להניע ביטוי מוגבר של הטרנסגן, למשל, בהקשר של בדיקת כתב מקבילה מסיבית (MPRA). MPRAs מציעים הרחבה רבת עוצמה של טכניקות אלה כדי לבדוק עד אלפי משפרים מועמדים לפעילות בו זמנית ותוארו בהרחבה במחקר גנומי 12,27,34,35,36. סינון תפוקה גבוה יותר מושג על ידי ביצוע שלבי שיבוט, אריזה, מסירה ורצף עבור משפרי מועמדים באצווה ולא בנפרד.
בחירת משפר מועמדים מספקת הזדמנות נוספת לגמישות (איור 2D). לדוגמה, בדיקה זו יכולה לשמש לזיהוי משפרים של גן מסוים, כדי לוודא את תפקודם של אזורי עניין ב- DNA שאינם מקודדים, או כדי לקבוע סוגי תאים ספציפיים או שלבים התפתחותיים שבמהלכם פעיל משפר – כל אלה משרתים מטרות הן במדע בסיסי והן בחקר מחלות. באופן כללי, בחירת משפר מועמדים מונעת על ידי תחזיות סיליקו של פעילות המשפר. בדרך כלל, תחזיות סיליקו כוללות ChIP-seq עבור שינויים היסטון המצביעים על משפרים אפשריים, כגון H3K27ac37 ומיפוי נגישות כרומטין38. לבסוף, תחום מחקר הולך וגדל הוא סינון מבוסס פונקציה של אלמנטים משפרים שתוכננו באופן סינתטי, המאפשר מחקרים על האופן שבו רצף משפר מכוון את פונקציה39 ותכנון של משפרים עם תכונות ספציפיות40.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת rAAV לפריסת טרנסגנים מונעי משפר במוח העכבר שלאחר הלידה. בפרוטוקול כללי זה, משפר מועמדים, מקדם מינימלי, גן מדווח ורצף ברקוד אופציונלי משוכפלים לתוך עמוד שדרה פלסמיד AAV. ניסויים אלה יכולים להיעשות עם רצף משפר מועמד יחיד או עם רצפים רבים במקביל. הפלסמיד נארז לתוך rAAV ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הריצוף בוצע בליבת טכנולוגיות הדנ”א של אוניברסיטת קליפורניה בדייוויס. אנו מודים למעבדה של לין טיאן באוניברסיטת קליפורניה בדייוויס על ההכשרה על אריזות rAAV והעניקה לנו בנדיבות עוזר AAV ופלסמידים של נציג / כובע. עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIGMS R35GM119831.
Materials
| 10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
| 5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| 5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
| Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
| Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
| Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
| Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
| Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
| Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
| Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
| Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
| Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
| HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
| IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
| LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
| McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
| Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
| NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | |
| Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
| Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
| Powdered milk | Sunny Select | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
| Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
| Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
| Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
| SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
| Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
| TAE buffer | Apex | 20-194 | |
| Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |
Referencias
- Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
- Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
- Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
- Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
- Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
- Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
- Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
- Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
- Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
- Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
- Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
- Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
- Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
- Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
- DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
- Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
- Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
- Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
- Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
- Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
- Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
- Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
- Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
- Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
- Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
- King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
- Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
- Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
- Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
- Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
- He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
- Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
- Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
- Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
- Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
- Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
- Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
- Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
- Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
- Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
- Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
- Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
- Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
- Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
- Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
- Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
- Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
- Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
- Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).
