Contrôles d’antigènes synthétiques pour l’immunohistochimie
Summary
Ce travail documente une méthode simple pour créer des contrôles d’antigènes synthétiques pour l’immunohistochimie. La technique est adaptable à une variété d’antigènes dans une large gamme de concentrations. Les échantillons fournissent une référence pour évaluer la performance et la reproductibilité intra et inter-essais.
Abstract
Les tests d’immunohistochimie (IHC) fournissent des informations précieuses sur les modèles d’expression des protéines, dont l’interprétation fiable nécessite des échantillons témoins positifs et négatifs bien caractérisés. Étant donné que les contrôles appropriés des tissus ou des lignées cellulaires ne sont pas toujours disponibles, une méthode simple pour créer des contrôles IHC synthétiques peut être bénéfique. Une telle méthode est décrite ici. Il est adaptable à divers types d’antigènes, y compris les protéines, les peptides ou les oligonucléotides, dans une large gamme de concentrations. Ce protocole explique les étapes nécessaires à la création de contrôles d’antigènes synthétiques, en utilisant comme exemple un peptide de l’oncogène érythroblastique humain B2 (ERBB2/HER2) domaine intracellulaire (DCI) reconnu par une variété d’anticorps pertinents sur le plan diagnostique. Les dilutions en série du peptide HER2 ICD dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) sont mélangées avec du formaldéhyde et chauffées pendant 10 min à 85 °C pour solidifier et réticuler le mélange peptide/BSA. Le gel résultant peut être traité, sectionné et coloré comme un tissu, produisant une série d’échantillons de concentrations d’antigènes connues couvrant un large éventail d’intensités de coloration.
Ce protocole simple est conforme aux procédures de laboratoire d’histologie de routine. La méthode exige seulement que l’utilisateur ait une quantité suffisante de l’antigène souhaité. Les protéines recombinantes, les domaines protéiques ou les peptides linéaires qui codent des épitopes pertinents peuvent être synthétisés localement ou commercialement. Les laboratoires générant des anticorps internes peuvent réserver des aliquotes de l’antigène immunisant comme cible de contrôle synthétique. La possibilité de créer des témoins positifs bien définis sur un large éventail de concentrations permet aux utilisateurs d’évaluer les performances des essais intra et interlaboratoires, de mieux comprendre la plage dynamique et la linéarité de leurs essais et d’optimiser les conditions d’essai pour leurs objectifs expérimentaux particuliers.
Introduction
L’immunohistochimie (IHC) permet la détection sensible et spécifique, spatialement précise, des antigènes cibles dans les coupes de tissus fixées au formol et incorporées à la paraffine (FFPE). Cependant, les résultats de la coloration IHC peuvent être affectés par de multiples variables, y compris le temps d’ischémie chaude et froide, la fixation des tissus, le prétraitement des tissus, la réactivité et la concentration d’anticorps, la chimie de détection des tests et les temps de réaction1. Par conséquent, la performance reproductible et l’interprétation des réactions IHC nécessitent un contrôle rigoureux de ces variables et l’utilisation d’échantillons témoins positifs et négatifs bien caractérisés. Les témoins fréquemment utilisés comprennent des tissus incorporés dans la paraffine ou des lignées cellulaires cultivées connues à partir d’analyses indépendantes pour exprimer l’antigène d’intérêt, mais de tels échantillons ne sont pas toujours disponibles1. De plus, les niveaux d’expression des antigènes cibles dans les tissus et les contrôles de lignées cellulaires ne sont généralement compris que qualitativement et peuvent être variables. Les témoins contenant des concentrations reproductibles et connues avec précision de l’antigène cible peuvent aider à optimiser les conditions de réaction de l’IHC. Une méthode générale, adaptable à une variété de types d’antigènes dans une gamme de concentrations physiologiquement pertinentes pour créer des échantillons synthétiques de contrôle IHC, a été décrite par les auteurs2. Un protocole détaillé est fourni ici pour la création et l’utilisation de ce type de norme.
Des contrôles appropriés sont essentiels pour l’interprétation valide des tests IHC 1,3,4. Des tissus, des cellules cultivées et des substrats enrobés de peptides ont été utilisés comme témoins IHC en fonction des besoins spécifiques des chercheurs. Les avantages et les limites inhérents à l’utilisation de tissus comme témoins IHC ont été largement discutés 1,4. Pour de nombreux anticorps, des témoins appropriés peuvent être choisis parmi des tissus normaux sélectionnés contenant des populations cellulaires exprimant l’antigène cible sur une large plage dynamique. Les témoins tissulaires sont moins appropriés lorsque l’antigène cible n’est pas bien caractérisé en ce qui concerne le site d’expression ou l’abondance, ou lorsque des antigènes à réaction croisée potentielle sont co-exprimés dans les mêmes cellules ou sites tissulaires. Dans ces contextes, des blocs de lignées cellulaires cultivées exprimant l’antigène d’intérêt peuvent être utiles. Pour fournir des preuves supplémentaires de la spécificité de la cible, les lignées cellulaires peuvent être conçues pour surexprimer ou sous-exprimer les antigènes cibles. Par exemple, une telle approche a récemment été utilisée pour évaluer une variété de tests anti–L1 à l’aide d’un microréseau tissulaire de lignées cellulaires isogéniques exprimant une gamme d’antigène-L15. Les limites pratiques à l’utilisation systématique des blocs de lignées cellulaires comprennent le coût et le temps nécessaires pour produire un nombre suffisant de cellules et le fait que l’expression de certains antigènes peut ne pas être cohérente de manière fiable, même au sein des lignées cellulaires clonales6. Les peptides synthétiques sont une troisième option pour les contrôles IHC pour les anticorps qui reconnaissent les épitopes linéaires courts. Steven Bogen et ses collègues ont publié de nombreux articles sur l’utilisation de peptides couplés à la surface des lames de verre 7,8 et des perles de verre9. Une étude de ce groupe a démontré que l’analyse quantitative des contrôles IHC à base de peptides pouvait détecter la variation du processus de coloration manquée par l’évaluation qualitative des contrôles tissulaires analysés en parallèle10. Bien que les normes utilisant des antigènes à base de billes puissent être largement applicables, de nombreux détails sont la propriété des auteurs, ce qui limite l’adoption généralisée.
Une autre approche des normes IHC incorpore des antigènes cibles dans des gels protéiques créés artificiellement. Ce concept a été démontré pour la première fois par Per Brandtzaeg en 1972 dans une étude dans laquelle le sérum de lapin normal a été polymérisé à l’aide de glutaraldéhyde11. De petits blocs du gel résultant ont ensuite été trempés pendant 1 à 4 semaines dans des solutions contenant les antigènes d’immunoglobulines d’intérêt à différentes concentrations. Après fixation de l’alcool et incorporation de paraffine, il a été démontré que des sections des témoins résultants se coloraient avec des intensités correspondant au logarithme des solutions antigéniques dans lesquelles elles avaient été trempées. Plus tard, les chercheurs ont préparé des conjugués de glutaraldéhyde d’acides aminés spécifiques dans des solutions diluées de BSA ou d’homogénat du cerveau comme témoins positifs dans des études de microscopie immuno-électronique12,13. Des travaux plus récents ont étudié l’utilisation de gels fabriqués à partir de solutions protéiques fixées au formaldéhyde comme substituts pour les tissus FFPE dans l’analyse par spectrométrie de masse14. Un autre travail récent a étudié la structure et les propriétés des gels formés en chauffant des solutions d’albumine sérique humaine ou bovine à diverses concentrations et pH15. Ces auteurs ont constaté que l’albumine sérique forme trois types de gels différant par leur élasticité mécanique, leur préservation de la structure secondaire et leur capacité de liaison aux acides gras en fonction des conditions expérimentales. Ensemble, ces documents démontrent la faisabilité générale de l’approche employée ici. Les solutions protéiques de composition définie créent des gels tissulaires qui peuvent être traités, sectionnés et colorés à l’aide de méthodes histologiques de routine.
Ce protocole décrit la formation d’un contrôle IHC synthétique fabriqué à partir d’albumine sérique bovine (BSA) polymérisée avec de la chaleur et du formaldéhyde. Les gels peuvent incorporer une grande variété d’antigènes, y compris des protéines pleine longueur, des domaines protéiques et des peptides linéaires, ainsi que des antigènes non protéiques, y compris des oligonucléotides2. Cette démonstration utilise un exemple d’antigène, un peptide linéaire codant pour les acides aminés C-terminal 16 de la protéine humaine ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (voir Tableau des matériaux). Cette séquence comprend les épitopes reconnus par trois anticorps disponibles dans le commerce et pertinents sur le plan diagnostique, y compris le réactif polyclonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) et les anticorps monoclonaux CB11 (AENPEYL) et 4B5 (TAENPEYLGL) (voir tableau des matériaux)16.
La méthode démontrée ici utilise des réactifs facilement disponibles en utilisant des processus et des techniques familiers à tout laboratoire d’histologie en exercice. La limitation la plus importante est la nécessité d’identifier et d’acheter les antigènes cibles, ce qui peut être accompli dans de nombreux cas à un coût relativement modeste. Parce que ces contrôles synthétiques sont de composition entièrement définie et fabriqués avec des méthodes simples, ils peuvent être mis en œuvre dans de nombreux laboratoires avec des résultats reproductibles. Leur utilisation peut faciliter l’évaluation objective et quantifiable des résultats de coloration IHC et permettre une plus grande reproductibilité intra- et inter-laboratoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode permet à l’utilisateur de créer des échantillons uniformes de composition connue et de concentration d’antigènes comme normes dans les réactions IHC, en utilisant des matériaux et des techniques familiers à la plupart des laboratoires d’histologie. L’étape la plus cruciale consiste à identifier l’épitope auquel l’anticorps d’intérêt se lie. Ce protocole décrit l’utilisation d’un antigène peptidique linéaire de l’ICD ERBB2/HER2. Le même protocole peut être utilisé pour …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient leurs collègues Jeffrey Tom et Aimin Song pour la synthèse peptidique, Nianfeng Ge pour la construction de TMA, Shari Lau pour la coloration IHC, Melissa Edick pour le balayage microscopique numérique et Hai Ngu pour la quantification d’images numériques.
Materials
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
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