Controlli dell'antigene sintetico per l'immunoistochimica

Summary

Questo lavoro documenta un metodo semplice per creare controlli di antigeni sintetici per l’immunoistochimica. La tecnica è adattabile a una varietà di antigeni in una vasta gamma di concentrazioni. I campioni forniscono un riferimento con cui valutare le prestazioni e la riproducibilità intra e inter-test.

Abstract

I saggi di immunoistochimica (IHC) forniscono preziose informazioni sui modelli di espressione proteica, la cui interpretazione affidabile richiede campioni di controllo positivi e negativi ben caratterizzati. Poiché non sono sempre disponibili controlli appropriati per tessuti o linee cellulari, un metodo semplice per creare controlli IHC sintetici può essere utile. Tale metodo è descritto qui. È adattabile a vari tipi di antigene, tra cui proteine, peptidi o oligonucleotidi, in una vasta gamma di concentrazioni. Questo protocollo spiega i passaggi necessari per creare controlli dell’antigene sintetico, utilizzando come esempio un peptide dal dominio intracellulare (ICD) dell’oncogene eritroblastico umano B2 (ERBB2/HER2) riconosciuto da una varietà di anticorpi diagnosticamente rilevanti. Le diluizioni seriali del peptide HER2 ICD in soluzione di albumina sierica bovina (BSA) vengono miscelate con formaldeide e riscaldate per 10 minuti a 85 °C per solidificare e reticolare la miscela peptide/BSA. Il gel risultante può essere lavorato, sezionato e colorato come un tessuto, producendo una serie di campioni di concentrazioni di antigene note che coprono una vasta gamma di intensità di colorazione.

Questo semplice protocollo è coerente con le procedure di laboratorio di istologia di routine. Il metodo richiede solo che l’utente abbia una quantità sufficiente dell’antigene desiderato. Proteine ricombinanti, domini proteici o peptidi lineari che codificano epitopi rilevanti possono essere sintetizzati localmente o commercialmente. I laboratori che generano anticorpi interni possono riservare aliquote dell’antigene immunizzante come bersaglio di controllo sintetico. L’opportunità di creare controlli positivi ben definiti su una vasta gamma di concentrazioni consente agli utenti di valutare le prestazioni dei test intra e interlaboratorio, ottenere informazioni sulla gamma dinamica e la linearità dei loro saggi e ottimizzare le condizioni di analisi per i loro particolari obiettivi sperimentali.

Introduction

L’immunoistochimica (IHC) consente il rilevamento sensibile e specifico, spazialmente preciso di antigeni bersaglio in sezioni di tessuto fissate in formalina, incorporate in paraffina (FFPE). Tuttavia, i risultati della colorazione IHC possono essere influenzati da più variabili, tra cui il tempo di ischemia calda e fredda, la fissazione dei tessuti, il pretrattamento dei tessuti, la reattività e la concentrazione degli anticorpi, la chimica di rilevamento del saggio e i tempi di reazione¹. Di conseguenza, le prestazioni riproducibili e l’interpretazione delle reazioni IHC richiedono un controllo rigoroso di queste variabili e l’uso di campioni di controllo positivi e negativi ben caratterizzati. I controlli frequentemente utilizzati includono tessuti incorporati in paraffina o linee cellulari in coltura conosciute da analisi indipendenti per esprimere l’antigene di interesse, ma tali campioni non sono sempre disponibili¹. Inoltre, i livelli di espressione degli antigeni bersaglio nei tessuti e nei controlli delle linee cellulari sono generalmente compresi solo qualitativamente e possono essere variabili. I controlli contenenti concentrazioni riproducibili e note con precisione dell’antigene bersaglio possono aiutare nell’ottimizzazione delle condizioni di reazione IHC. Un metodo generale, adattabile a una varietà di tipi di antigene in un intervallo fisiologicamente rilevante di concentrazioni per creare campioni sintetici di controllo IHC, è stato descritto dagli autori². Un protocollo dettagliato è fornito qui per la creazione e l’uso di questo tipo di standard.

Controlli appropriati sono essenziali per la valida interpretazione dei saggi IHC ^1,3,4. Tessuti, cellule coltivate e substrati rivestiti di peptidi sono stati impiegati come controlli IHC in base alle esigenze specifiche dei ricercatori. I vantaggi e le limitazioni inerenti all’uso dei tessuti come controlli IHC sono stati ampiamente discussi ^1,4. Per molti anticorpi, è possibile scegliere controlli appropriati tra tessuti normali selezionati contenenti popolazioni cellulari che esprimono l’antigene bersaglio in un ampio intervallo dinamico. I controlli tissutali sono meno adatti quando l’antigene bersaglio non è ben caratterizzato per quanto riguarda il sito di espressione o l’abbondanza, o quando gli antigeni potenzialmente a reazione incrociata sono co-espressi nelle stesse cellule o siti tissutali. In questi contesti, blocchi di linee cellulari in coltura che esprimono l’antigene di interesse possono essere utili. Per fornire ulteriori prove della specificità del bersaglio, le linee cellulari possono essere progettate per sovra-o sotto-esprimere antigeni bersaglio. Ad esempio, tale approccio è stato recentemente utilizzato per valutare una varietà di saggi anti-PD-L1 utilizzando un microarray tissutale di linee cellulari isogeniche che esprimono una gamma di antigene PD-L1⁵. Le limitazioni pratiche all’uso di routine dei blocchi di linee cellulari includono il costo e il tempo necessari per produrre un numero di cellule sufficiente e il fatto che l’espressione di alcuni antigeni potrebbe non essere coerente in modo affidabile, anche all’interno delle linee cellulari clonali⁶. I peptidi sintetici sono una terza opzione per i controlli IHC per gli anticorpi che riconoscono gli epitopi lineari corti. Steven Bogen e colleghi hanno pubblicato ampiamente sull’uso di peptidi accoppiati alla superficie di vetrini ^7,8 e perle di vetro⁹. Uno studio di questo gruppo ha dimostrato che l’analisi quantitativa dei controlli IHC basati su peptidi potrebbe rilevare la variazione del processo di colorazione mancata dalla valutazione qualitativa dei controlli tissutali analizzati in parallelo¹⁰. Mentre gli standard che utilizzano antigeni basati su perline potrebbero essere ampiamente applicabili, molti dettagli sono proprietari degli autori, limitando l’adozione diffusa.

Un altro approccio agli standard IHC incorpora antigeni bersaglio in gel proteici creati artificialmente. Questo concetto è stato dimostrato per la prima volta da Per Brandtzaeg nel 1972 in uno studio in cui il normale siero di coniglio è stato polimerizzato usando glutaraldeide¹¹. Piccoli blocchi del gel risultante sono stati poi immersi per 1-4 settimane in soluzioni contenenti gli antigeni immunoglobuline di interesse a varie concentrazioni. Dopo la fissazione dell’alcol e l’incorporazione della paraffina, è stato dimostrato che sezioni dei controlli risultanti si coloravano con intensità corrispondenti al logaritmo delle soluzioni antigeniche in cui erano state immerse. Successivamente, i ricercatori hanno preparato coniugati di glutaraldeide di aminoacidi specifici in BSA diluito o soluzioni omogenee cerebrali come controlli positivi negli studi di microscopia immuno-elettronica^12,13. Lavori più recenti hanno studiato l’uso di gel a base di soluzioni proteiche fissate alla formaldeide come surrogati del tessuto FFPE nell’analisi di spettrometria di massa¹⁴. Un altro lavoro recente ha studiato la struttura e le proprietà dei gel formati riscaldando soluzioni di albumina sierica umana o bovina a varie concentrazioni e pH¹⁵. Questi autori hanno scoperto che l’albumina sierica forma tre tipi di gel che differiscono per elasticità meccanica, conservazione della struttura secondaria e capacità di legame con gli acidi grassi a seconda delle condizioni sperimentali. Insieme, questi documenti dimostrano la fattibilità generale dell’approccio qui impiegato. Le soluzioni proteiche di composizione definita creano gel simili a tessuti che possono essere ulteriormente elaborati, sezionati e colorati utilizzando metodi istologici di routine.

Questo protocollo descrive la formazione di un controllo IHC sintetico a base di albumina sierica bovina (BSA) polimerizzata con calore e formaldeide. I gel possono incorporare un’ampia varietà di antigeni, tra cui proteine a lunghezza intera, domini proteici e peptidi lineari, nonché antigeni non proteici tra cui oligonucleotidi². Questa dimostrazione utilizza un antigene di esempio un peptide lineare che codifica per gli amminoacidi C-terminal 16 della proteina umana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (vedi Tabella dei materiali). Questa sequenza include gli epitopi riconosciuti da tre anticorpi diagnosticamente rilevanti disponibili in commercio, tra cui il reagente policlonale Herceptest (ENPEYLGLDVP) e gli anticorpi monoclonali CB11 (AENPEYL) e 4B5 (TAENPEYLGL) (vedi Tabella dei materiali)¹⁶.

Il metodo qui dimostrato impiega reagenti prontamente disponibili utilizzando processi e tecniche familiari a qualsiasi laboratorio di istologia praticante. La limitazione più significativa è la necessità di identificare e acquistare gli antigeni bersaglio, che può essere realizzato in molti casi a un costo relativamente modesto. Poiché questi controlli sintetici sono di composizione completamente definita e realizzati con metodi semplici, possono essere implementati in molti laboratori con risultati riproducibili. Il loro uso può facilitare la valutazione oggettiva e quantificabile dei risultati della colorazione IHC e consentire una maggiore riproducibilità intra e interlaboratorio.

Protocol

1. Preparazione della soluzione madre e degli strumenti Preparare 20 mL di una soluzione BSA al 25% p/v mescolando 5 g di polvere di BSA in 14 mL di PBS, pH 7,2 in un tubo conico da 50 mL fino a disperdersi uniformemente. Vortice se necessario per disperdere la polvere BSA.Conservare la soluzione per una notte a 4 °C per consentire la completa dissoluzione. Regolare il volume finale a 20 ml con PBS per creare una soluzione stock al 25% p/v. Preparare 20 mL di una soluzione di BSA …

Representative Results

I peptidi devono dissolversi completamente in un solvente appropriato a temperatura ambiente per formare una soluzione otticamente chiara. Se il particolato visibile è ancora presente dopo 30-60 minuti, può essere utile aggiungere ulteriori volumi del solvente originale o di un solvente alternativo non superiore al volume previsto della soluzione madre peptidica 5x calcolata nella Tabella 1. Allo stesso modo, la soluzione combinata peptide/BSA deve rimanere traslucida (Figura 1A</s…

Discussion

Questo metodo consente all’utente di creare campioni uniformi di composizione nota e concentrazione di antigene come standard nelle reazioni IHC, utilizzando materiali e tecniche familiari alla maggior parte dei laboratori di istologia. Il passo più cruciale è identificare l’epitopo a cui si lega l’anticorpo di interesse. Questo protocollo descrive l’utilizzo di un antigene peptidico lineare dall’ICD ERBB2/HER2. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per formare gel BSA contenenti oligonucleotidi, etichette fluore…

Materials

Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088