Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen
Summary
Ruimtelijke afstand is een belangrijke parameter bij het beoordelen van hypoxie / reoxygenatieletsel in een co-cultuurmodel van afzonderlijke endotheel- en cardiomyocytencellagen, wat voor het eerst suggereert dat het optimaliseren van de co-culturele ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming.
Abstract
Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit. Reperfusie veroorzaakt extra letsel buiten ischemie. Endotheelcellen (EC’s) kunnen cardiomyocyten (CM’s) beschermen tegen reperfusieschade door cel-celinteracties. Coculturen kunnen helpen bij het onderzoeken van de rol van cel-cel interacties. Een gemengde co-kweek is de eenvoudigste benadering, maar is beperkt omdat geïsoleerde behandelingen en downstream-analyses van enkele celtypen niet haalbaar zijn. Om te onderzoeken of EC’s dosisafhankelijk CM-celschade kunnen dempen en of deze bescherming verder kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren, gebruikten we muis primaire coronaire endotheelcellen en volwassen muis cardiomyocyten om drie soorten celkweekinzetstukken te testen die varieerden in hun intercellelijke laagafstand bij 0,5, Respectievelijk 1,0 en 2,0 mm. In CMs-only nam cellulair letsel zoals beoordeeld door lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte significant toe tijdens hypoxie en verder na reoxygenatie wanneer de afstand 2,0 mm was in vergelijking met 0,5 en 1,0 mm. Wanneer EC’s en CM’s bijna direct contact hadden (0,5 mm), was er slechts een lichte demping van de reoxygenatieschade van CM’s na hypoxie. Deze demping werd aanzienlijk verhoogd wanneer de ruimtelijke afstand 1,0 mm was. Met een afstand van 2,0 mm verzwakten EC’s CM-letsel tijdens zowel hypoxie als hypoxie / reoxygenatie, wat aangeeft dat voldoende cultuurafstand nodig is voor EC’s om te kruisverwijzingen met CM’s, zodat uitgescheiden signaalmoleculen kunnen circuleren en beschermende paden volledig kunnen stimuleren. Onze bevindingen suggereren voor het eerst dat het optimaliseren van de EC / CM co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van EC’s in CM-bescherming tegen gesimuleerde ischemie / reperfusieletsel. Het doel van dit rapport is om onderzoekers een stapsgewijze aanpak te bieden om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.
Introduction
Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit 1,2. Het behandelingsproces van reperfusie kan echter zelf de dood van cardiomyocyten veroorzaken, bekend als myocardiale ischemie / reperfusie (IR) -letsel, waarvoor er nog steeds geen effectieve remedie is3. Er is gesuggereerd dat endotheelcellen (EC’s) cardiomyocyten (CMs) beschermen door de secretie van paracriene signalen, evenals cel-tot-cel interacties4.
Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van autocriene en /of paracriene cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Onder co-cultuurmodellen is gemengde co-cultuur de eenvoudigste, waarbij twee verschillende soorten cellen in direct contact staan binnen een enkel kweekcompartiment met een gewenste celverhouding5. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar gezien de gemengde populatie.
Eerdere studies toonden aan dat hypoxische en ischemische beledigingen aanzienlijke schade toebrengen aan de integriteit van het celmembraan zoals gemeten door de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH). Dit letsel wordt verergerd bij reoxygenatie, waarbij reperfusieletselwordt nagebootst 6,7,8. Het doel van het huidige protocol was om de hypothesen te testen dat de aanwezigheid van EC’s dosisafhankelijk celmembraanlekkage van CM’s veroorzaakt door hypoxie en reoxygenatie (HR) kan dempen en dat het beschermende effect van EC’s kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren. Daarom gebruikten we drie soorten celkweekinzetstukken en muis primaire coronaire endotheelcellen en cardiomyocyten van volwassen muizen. De inserts, gebrandmerkt door Corning, Merck Millipore en Greiner Bio-One, stelden ons in staat om drie verschillende celkweekkruisverwijzingen te creëren met intercellulaire afstanden van respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm. Per inzetstuk werden telkens 100.000 EC’s verguld.
Om te bepalen of de dichtheid van EC’s in co-cultuur bijdraagt aan hr-letselverzwakking in dit model, bestudeerden we bovendien de dosis-responsrelatie tussen EC-concentratie en LDH-afgifte door CM’s. EC’s werden geplateerd op respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 per insert in de insert van 2,0 mm.
Dit rapport biedt een stapsgewijze aanpak voor onderzoekers om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen in het protocol
Celco-cultuurmodellen zijn gebruikt om cellulaire mechanismen van cardioprotectie te bestuderen. Het creëren van twee afzonderlijke lagen met een betekenisvolle afstand ertussen is dus cruciaal voor de ontwikkeling van een geschikt co-cultuurmodel. Een uitdaging bij het bestuderen van gesimuleerde IR, d.w.z. HR, letsel is dat niet alleen ischemie (hypoxie) zelf, maar ook reperfusie (reoxygenatie) cellulaire disfunctie verergert. Daarom moet een realistisch model deze …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) en door institutionele fondsen aan M.L.R.
Materials
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
Referencias
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
- Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
- Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).
- Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
- vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
- Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661 (2011).
- Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711 (2012).
- Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661 (2011).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).
