Un système Explant pour les études d’imagerie time-lapse de l’assemblage de circuits olfactifs chez la drosophile
Summary
Ce protocole décrit la procédure de dissection, l’état de culture et l’imagerie en direct d’un système d’explantation antenne-cerveau pour l’étude de l’assemblage du circuit olfactif.
Abstract
Les neurones sont précisément interconnectés pour former des circuits essentiels au bon fonctionnement du cerveau. Le système olfactif de la drosophile fournit un excellent modèle pour étudier ce processus puisque 50 types de neurones récepteurs olfactifs (ORN) des antennes et des palpes maxillaires projettent leurs axones à 50 glomérules identifiables dans le lobe de l’antenne et forment des connexions synaptiques avec les dendrites de 50 types de neurones de projection de second ordre (NP). Les études précédentes se sont principalement concentrées sur l’identification de molécules importantes qui régulent le ciblage précis dans le circuit olfactif à l’aide de tissus fixes. Ici, un système d’explantation antenne-cerveau qui récapitule les étapes clés du développement de l’assemblage du circuit olfactif en culture est décrit. En disséquant la cuticule externe et en nettoyant les corps gras opaques recouvrant le cerveau nymphal en développement, des images de haute qualité de neurones uniques provenant de cerveaux vivants peuvent être collectées à l’aide de la microscopie à deux photons. Cela permet l’imagerie en accéléré d’un seul axone ORN ciblant à partir de tissus vivants. Cette approche aidera à révéler les contextes biologiques cellulaires importants et les fonctions importantes de gènes importants précédemment identifiés et à identifier les mécanismes qui sous-tendent le processus dynamique d’assemblage de circuits.
Introduction
Les neurones sont précisément interconnectés pour former des circuits essentiels au bon fonctionnement du cerveau. Depuis plus de 100 ans, les neuroscientifiques tentent de comprendre comment les neurites s’étendent vers leurs cibles intermédiaires et finales avec une extrême précision. En conséquence, ils ont identifié des gènes importants qui codent des signaux de guidage pour le développement de processus neuronaux1. Le système olfactif de la drosophile fournit un excellent modèle pour étudier ce processus puisque les neurones récepteurs olfactifs (ORN, les neurones sensoriels primaires) projettent à 50 glomérules identifiables avec une taille, une forme et une position relative stéréotypées, où ils forment des connexions synaptiques avec des dendrites à partir de 50 types de neurones de projection (NP) de second ordre, chacun envoyant des dendrites à l’un des 50 glomérules2 (Figure 1A ). Par conséquent, il est relativement facile d’identifier des phénotypes mutants à résolution synaptique (glomérulaire) dans le système olfactif de la mouche. Cela a conduit à la découverte de gènes importants qui régulent l’assemblage du circuitolfactif 3.
L’assemblage du circuit olfactif de la mouche repose sur des processus de développement coordonnés temporellement et spatialement3. Les ORN et les NP acquièrent des destins cellulaires distincts, ce qui met en place le programme pour leurs spécificités de câblage. Ensuite, les dendrites PN prémodèlent le lobe de l’antenne (Figure 1B). Les axones des ORN font ensuite le tour du lobe de l’antenne ipsilatérale et traversent la ligne médiane du cerveau pour atteindre le lobe de l’antenne controlatérale. Par la suite, les axones ORN envahissent les lobes antennes ipsi- et controlatéral et forment des synapses avec des dendrites de leurs PN partenaires dans des glomérules spécifiques. Ce modèle grossier pour l’assemblage de circuits olfactifs a été proposé sur la base de la caractérisation d’échantillons fixes à partir de points temporels intermédiaires au cours du développement. La mauvaise résolution temporelle et l’incapacité à suivre les mêmes processus neuronaux tout au long du développement à partir de tissus fixes limitent la compréhension mécaniste du processus d’assemblage de circuits.
Il est techniquement difficile de vivre des processus ORN et PN d’image in vivo, car le processus de câblage se produit dans la première moitié du stade nymphal lorsque le lobe de l’antenne est entouré d’un corps gras opaque à l’intérieur du boîtier nymphal. Il est donc impossible d’imager directement le circuit olfactif en développement à partir de pupes intactes. Les tissus disséqués cultivés ex vivo peuvent contourner l’opacité tissulaire et ont été utilisés avec succès pour étudier le développement neuronal 4,5,6. Le défi d’utiliser une stratégie de culture explant ex vivo similaire pour étudier le câblage neuronal dans le cerveau nymphal est de savoir s’il récapitule le ciblage précis des neurones dans une condition de culture. Sur la base d’une condition de culture ex vivo précédemment rapportée pour le complexe œil-cerveau de la mouche7, une explante qui contient l’ensemble du cerveau nymphal, les antennes et les nerfs antennenaires de connexion intacts a été récemment développée, qui conserve un ciblage précis du circuit olfactif et peut être soumise à une imagerie en direct basée sur la microscopie à deux photons jusqu’à 24 h à la fréquence de toutes les 20 min8 . Ici, un protocole détaillé de la culture et de l’imagerie des explants est décrit. Le système explant fournit une méthode puissante pour étudier l’assemblage du circuit olfactif et potentiellement d’autres circuits dans le cerveau central.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’explante cerveau antennes-drosophiles conserve un ciblage normal du circuit olfactif. Nous avons remarqué que le développement est 2 fois plus lent ex vivo par rapport à in vivo. Il est à noter que le système explant ne retient pas le palpe maxillaire, qui héberge six types d’ORN. Pour assurer un développement normal récapitulé ex vivo, l’étirement des nerfs antennels doit être évité pendant la dissection explant. Au cours de la culture ex vivo, la croissa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions N. Özel et R. Hiesinger pour leurs conseils sur la culture des explants; M. Wagner pour l’aide technique de la microscopie à deux photons; D.J. Luginbuhl pour la génération de mouches transgéniques; D. Friedmann pour des suggestions d’analyse de logiciels fidjiens; Y. Ge pour l’assistance au travail à la volée; C. McLaughlin et K.K.L. Wong pour leurs commentaires sur le manuscrit. L.L. est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute. Ce travail a été soutenu par les subventions 1K99DC01883001 (à T.L.) et R01-DC005982 (à L.L.).
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Referencias
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