Un sistema di espianto per studi di imaging time-lapse dell'assemblaggio di circuiti olfattivi in Drosophila

Summary

Questo protocollo descrive la procedura di dissezione, le condizioni di coltura e l’imaging dal vivo di un sistema di espianto antenna-cervello per lo studio dell’assemblaggio del circuito olfattivo.

Abstract

I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per studiare questo processo poiché 50 tipi di neuroni recettori olfattivi (ORN) dalle antenne e palpi mascellari proiettano i loro assoni a 50 glomeruli identificabili nel lobo antennale e formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione del secondo ordine (PN). Studi precedenti si sono concentrati principalmente sull’identificazione di molecole importanti che regolano il targeting preciso nel circuito olfattivo utilizzando tessuti fissi. Qui, viene descritto un sistema di espianto antenna-cervello che ricapitola le principali pietre miliari dello sviluppo dell’assemblaggio del circuito olfattivo in coltura. Attraverso la dissezione della cuticola esterna e la pulizia di corpi adiposi opachi che coprono il cervello pupale in via di sviluppo, immagini di alta qualità di singoli neuroni da cervelli vivi possono essere raccolte utilizzando la microscopia a due fotoni. Ciò consente l’imaging time-lapse di un singolo assone ORN mirato da tessuto vivo. Questo approccio aiuterà a rivelare importanti contesti e funzioni biologiche cellulari di geni importanti precedentemente identificati e identificare i meccanismi alla base del processo dinamico di assemblaggio del circuito.

Introduction

I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Per oltre 100 anni, i neuroscienziati hanno cercato di capire come i neuriti si estendono verso i loro obiettivi intermedi e finali con estrema precisione. Di conseguenza, hanno identificato geni importanti che codificano segnali di guida per lo sviluppo di processi neuronali¹. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per indagare questo processo poiché i neuroni recettori olfattivi (ORN, i neuroni sensoriali primari) proiettano a 50 glomeruli identificabili con dimensioni, forma e posizione relativa stereotipate, dove formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione (PN) di secondo ordine), ognuno dei quali invia dendriti a uno dei 50 glomeruli² (Figura 1A ). Pertanto, è relativamente facile identificare fenotipi mutanti a risoluzione sinaptica (glomerulare) nel sistema olfattivo della mosca. Ciò ha portato alla scoperta di importanti geni che regolano l’assemblaggio del circuito olfattivo³.

L’assemblaggio del circuito olfattivo della mosca si basa su processi di sviluppo temporalmente e spazialmente coordinati³. ORN e PN acquisiscono destini cellulari distinti, che impostano il programma per le loro specificità di cablaggio. Successivamente, i dendriti PN prepatterano il lobo antennale (Figura 1B). Gli assoni degli ORN circumnavigano quindi il lobo antennale ipsilaterale e attraversano la linea mediana del cervello per raggiungere il lobo antennale controlaterale. Successivamente, gli assoni ORN invadono sia i lobi antennali ipsi- che controlaterali e formano sinapsi con dendriti dei loro PT partner in glomeruli specifici. Questo modello grossolano per l’assemblaggio di circuiti olfattivi è stato proposto sulla base della caratterizzazione di campioni fissi da punti temporali intermedi durante lo sviluppo. La scarsa risoluzione temporale e l’incapacità di seguire gli stessi processi neuronali attraverso lo sviluppo da tessuto fisso limitano la comprensione meccanicistica del processo di assemblaggio del circuito.

È tecnicamente difficile vivere i processi ORN e PN in vivo poiché il processo di cablaggio avviene nella prima metà dello stadio pupale quando il lobo antennale è circondato da un corpo grasso opaco all’interno della custodia pupale. È quindi impossibile visualizzare direttamente il circuito olfattivo in via di sviluppo da pupe intatte. I tessuti sezionati coltivati ex vivo possono aggirare l’opacità tissutale e sono stati utilizzati con successo per studiare lo sviluppo neurale ^4,5,6. La sfida di utilizzare una simile strategia di coltura di espianto ex vivo per studiare il cablaggio neuronale nel cervello pupale è se ricapitola il targeting preciso del neurone in una condizione di coltura. Sulla base di una condizione di coltura ex vivo precedentemente riportata per il complesso occhio-cervello della mosca⁷, è stato recentemente sviluppato un espianto che contiene intatto l’intero cervello pupale, le antenne e i nervi antennali di collegamento, che mantiene un targeting preciso del circuito olfattivo e può essere sottoposto a imaging dal vivo basato su microscopia a due fotoni per un massimo di 24 ore alla frequenza di ogni 20 min⁸ . Qui viene descritto un protocollo dettagliato della coltura e dell’imaging di espianto. Il sistema di espianto fornisce un metodo potente per studiare l’assemblaggio del circuito olfattivo e potenzialmente altri circuiti nel cervello centrale.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti NOTA: Tutte le fasi di questo protocollo vengono eseguite a temperatura ambiente (20-25 °C) se non diversamente specificato. Per preparare il piatto di coltura per immobilizzare l’espianto durante l’imaging time lapse, posare Sylgard di 0,5 cm di spessore (mescolare accuratamente due componenti liquidi con un rapporto 10: 1 prima dell’uso) sulla superficie inferiore di una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarla polimerizzare per 4…

Representative Results

Gli assoni ORN arrivano al lobo antennale tra 18 h e 36 h APF. Quindi navigano nel lobo dell’antenna, attraversano la linea mediana e innervano i glomeruli. Il video 1 è un video rappresentativo che mostra l’intero processo per diversi assoni identificabili individualmente, preso alla frequenza di ogni 20 minuti per 24 ore. Prima della registrazione con TurboReg, gli assoni mostrano una deriva laterale mentre il cervello si sviluppa (prima metà del video). Dopo la registrazione, la deriva viene corrett…

Discussion

L’espianto cervello delle antenne della Drosophila mantiene il normale targeting del circuito olfattivo. Abbiamo notato che lo sviluppo è 2 volte più lento ex vivo rispetto a in vivo. Si noti che il sistema di espianto non mantiene il palpo mascellare, che ospita sei tipi di ORN. Per garantire che lo sviluppo normale sia ricapitolato ex vivo, è necessario evitare lo stiramento dei nervi antennali durante la dissezione dell’impianto. Durante la coltura ex vivo la crescita ba…

Materials

20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000