Summary

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

Published: October 13, 2021
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Summary

このプロトコルは、嗅覚回路アセンブリの研究のためのアンテナ – 脳外植システムの解剖手順、培養状態、およびライブイメージングを記述する。

Abstract

〜ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。 ショウジョウバエ の嗅覚系は、触角および上顎触診からの50種類の嗅覚受容体ニューロン(ORN)が軸索を触角葉の50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の二次突起ニューロン(PN)からの樹状突起とのシナプス接続を形成するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供する。これまでの研究では、主に、固定組織を用いて嗅覚回路における正確な標的化を調節する重要な分子を同定することに焦点を当てていた。ここでは、培養における嗅覚回路アセンブリの重要な発達マイルストーンを反復するアンテナ脳外植システムについて説明する。外側のキューティクルを解剖し、発達中の蛹の脳を覆っている不透明な脂肪体を洗浄することで、生きた脳からの単一のニューロンの高品質の画像を2光子顕微鏡で収集することができます。これにより、生組織からの単一のORN軸索ターゲティングのタイムラプス画像化が可能になる。このアプローチは、以前に同定された重要な遺伝子の重要な細胞生物学的背景と機能を明らかにし、回路アセンブリの動的プロセスを支えるメカニズムを特定するのに役立ちます。

Introduction

ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。100年以上にわたり、神経科学者は、神経突起が中間および最終標的に向かって非常に正確にどのように拡張するかを理解しようとしてきました。その結果、彼らはニューロンプロセスを発達させるためのガイダンス手がかりをコードする重要な遺伝子を同定した1ショウジョウバエ の嗅覚系は、嗅覚受容体ニューロン(ORN、一次感覚ニューロン)がステレオタイプなサイズ、形状、相対位置を持つ50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の2次突起ニューロン(PN)の樹状突起とシナプス結合を形成し、それぞれが樹状突起を50個の糸球体2 の1つに送信するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供します(図1A).したがって、フライ嗅覚系におけるシナプス(糸球体)分解能で変異表現型を同定することは比較的容易である。これにより、嗅覚回路アセンブリ3を調節する重要な遺伝子の発見につながった。

フライ嗅覚回路の組み立ては、時間的および空間的に調整された発生プロセスに依存する3。ORNとPNは、配線の特異性のためにプログラムを設定する別個のセル運命を獲得します。次に、PNデンドライトが触角ローブを予めパターン化する(図1B)。その後、ORNの軸索は同側触角葉を周回し、脳の正中線を横切って対側触角葉に到達する。続いて、ORN軸索は、イプシ側および対側触角葉の両方に侵入し、特定の糸球体におけるパートナーPNの樹状突起とシナプスを形成する。嗅覚回路アセンブリのためのこの粗いモデルは、開発中の中間時点からの固定サンプルの特性評価に基づいて提案された。時間分解能が低く、固定組織からの発生全体にわたって同じニューロンプロセスに従うことができないため、回路アセンブリプロセスの機構的理解が制限されます。

蛹のケース内で触角葉が不透明な脂肪体に囲まれている場合、配線プロセスは蛹期の前半に起こるため、生体内で生きている画像ORNおよびPNプロセスを行うことは技術的に困難です。したがって、無傷の蛹から発達中の嗅覚回路を直接画像化することは不可能である。エクスビボで培養された解剖された組織は、組織の不透明度を回避することができ、神経発達の研究に首尾よく使用されている456同様のエクスビボ外植体培養戦略を使用して、蛹脳内のニューロン配線を研究することの課題は、それが培養条件下で標的化される正確なニューロンを反復するかどうかである。フライアイ-脳複合体7の既報のエクスビボ培養条件に基づいて、蛹脳全体、アンテナ、および接続する触角神経をそのまま含む外植体が最近開発され、嗅覚回路の正確な標的を保持し、20分ごとの頻度で最大24時間の2光子顕微鏡ベースのライブイメージングに供することができる8.ここでは、外植体培養および画像化の詳細なプロトコールが説明される。外植システムは、中枢脳における嗅覚回路および潜在的に他の回路の集合を研究するための強力な方法を提供する。

Protocol

1. 試薬の調製 メモ: このプロトコルのすべての手順は、特に説明がない限り、室温 (20 ~ 25 °C) で実行されます。 タイムラプスイメージング中に外植体を固定化するための培養皿を準備するために、厚さ0.5cmのシルガード(使用前に2つの液体成分を10:1の比率で十分に混合する)を60mm×15mmのシャーレの底面に敷き詰め、室温で48時間硬化させる(<strong class="x…

Representative Results

ORN軸索は、18時間から36時間APFの間の触角葉に到着する。その後、触角葉をナビゲートし、正中線を横切り、糸球体を神経支配します。ビデオ1は、20分毎の頻度で24時間撮影された、個々に識別可能ないくつかの軸索の全プロセスを示す代表的な ビデオ である。TurboRegを使用して登録する前に、軸索は脳が発達するにつれていくらかの横方向の漂流を示す(ビデオの前半)。登録後?…

Discussion

ショウジョウバエのアンテナ脳外植体は、嗅覚回路の正常な標的を保持している。我々は、開発がin vivoと比較して2倍遅いex vivoであることに気付きました。外植系は、6種類のORNを宿主とする上顎触診を保持しないことに留意されたい。正常な発達がエクスビボで反復されることを確実にするために、外植体解剖中に触角神経の伸張を避ける必要がある。エクス?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、外植文化に関するアドバイスをしてくれたN. ÖzelとR. Hiesingerに感謝します。M. ワーグナー 二光子顕微鏡の技術的支援;トランスジェニックハエを生成するためのD.J.ルギンブール;D.フリードマンフィジーソフトウェア分析の提案;Y. Ge 飛行作業の援助のため;C. McLaughlin と K.K.L. Wong が原稿に関するコメントを募集しています。L.L.はハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。この研究は、国立衛生研究所の助成金1K99DC01883001(T.L.へ)とR01-DC005982(L.L.へ)によって支援されました。

Materials

20-hydroxyecdysone Sigma H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser Coherent Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
Human insulin Thermo Fisher Scientific 12585014
Imaging software Prairie
Micro Scissors World Precision Instruments 501778
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10
Oxygen cylinder Praxair OX M-E
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Schneider’s Drosophila Medium Thermo Fisher Scientific 21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Thermo Fisher Scientific NC0162601
Two-photon microscopy Bruker
water immerse objective (20X) Zeiss 421452-9800-000

Referencias

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Citar este artículo
Li, T., Luo, L. An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila. J. Vis. Exp. (176), e62983, doi:10.3791/62983 (2021).

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