Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila
Summary
Este protocolo describe el procedimiento de disección, la condición de cultivo y las imágenes en vivo de un sistema de explante antena-cerebro para el estudio del ensamblaje del circuito olfativo.
Abstract
Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que 50 tipos de neuronas receptoras olfativas (ORN) de las antenas y palpos maxilares proyectan sus axones a 50 glomérulos identificables en el lóbulo antenal y forman conexiones sinápticas con dendritas de 50 tipos de neuronas de proyección de segundo orden (PN). Estudios previos se centraron principalmente en identificar moléculas importantes que regulan la orientación precisa en el circuito olfativo utilizando tejidos fijos. Aquí, se describe un sistema de explante antena-cerebro que recapitula los hitos clave del desarrollo del ensamblaje del circuito olfativo en cultivo. A través de la disección de la cutícula externa y la limpieza de cuerpos grasos opacos que cubren el cerebro pupal en desarrollo, se pueden recopilar imágenes de alta calidad de neuronas individuales de cerebros vivos utilizando microscopía de dos fotones. Esto permite obtener imágenes de lapso de tiempo de un solo axón ORN dirigido desde tejido vivo. Este enfoque ayudará a revelar contextos biológicos celulares importantes y funciones de genes importantes previamente identificados e identificar mecanismos que sustentan el proceso dinámico de ensamblaje de circuitos.
Introduction
Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. Durante más de 100 años, los neurocientíficos han estado tratando de comprender cómo las neuritas se extienden hacia sus objetivos intermedios y finales con extrema precisión. Como resultado, han identificado genes importantes que codifican señales de guía para el desarrollo de procesos neuronales1. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que las neuronas receptoras olfativas (ORN, las neuronas sensoriales primarias) se proyectan a 50 glomérulos identificables con tamaño, forma y posición relativa estereotipados, donde forman conexiones sinápticas con dendritas de 50 tipos de neuronas de proyección de segundo orden (PN), cada una de las cuales envía dendritas a uno de los 50 glomérulos2 (Figura 1A ). Por lo tanto, es relativamente fácil identificar fenotipos mutantes a resolución sináptica (glomerular) en el sistema olfativo de la mosca. Esto llevó a descubrimientos de genes importantes que regulan el ensamblaje del circuito olfativo3.
El ensamblaje del circuito olfativo de la mosca se basa en procesos de desarrollo coordinados temporal y espacialmente3. Los ORN y los PN adquieren destinos celulares distintos, que configuran el programa para sus especificidades de cableado. A continuación, las dendritas PN prepatronan el lóbulo antenal (Figura 1B). Los axones de los ORN luego circunnavegan el lóbulo antenal ipsilateral y cruzan la línea media del cerebro para llegar al lóbulo antenal contralateral. Posteriormente, los axones ORN invaden los lóbulos antenales ipsi- y contralaterales y forman sinapsis con dendritas de sus compañeros PNs en glomérulos específicos. Este modelo grueso para el ensamblaje de circuitos olfativos se propuso a partir de la caracterización de muestras fijas a partir de puntos de tiempo intermedios durante el desarrollo. La mala resolución temporal y la incapacidad de seguir los mismos procesos neuronales a través del desarrollo a partir de tejido fijo limitan la comprensión mecanicista del proceso de ensamblaje del circuito.
Es técnicamente difícil vivir los procesos orn y PN in vivo, ya que el proceso de cableado ocurre en la primera mitad de la etapa pupal cuando el lóbulo antenal está rodeado por un cuerpo de grasa opaco dentro de la caja pupal. Por lo tanto, es imposible obtener imágenes directas del circuito olfativo en desarrollo a partir de pupas intactas. Los tejidos disecados cultivados ex vivo pueden eludir la opacidad tisular y se han utilizado con éxito para estudiar el desarrollo neuronal 4,5,6. El desafío de usar una estrategia de cultivo de explante ex vivo similar para estudiar el cableado neuronal en el cerebro pupal es si recapitula la orientación neuronal precisa en una condición de cultivo. Sobre la base de una condición de cultivo ex vivo previamente informada para el complejo ojo de mosca-cerebro7, recientemente se ha desarrollado un explante que contiene todo el cerebro pupal, las antenas y los nervios antenales de conexión intactos, que conserva la orientación precisa del circuito olfativo y puede someterse a imágenes en vivo basadas en microscopía de dos fotones durante hasta 24 h a la frecuencia de cada 20 min8 . Aquí, se describe un protocolo detallado del cultivo de explante y las imágenes. El sistema de explante proporciona un método poderoso para estudiar el ensamblaje del circuito olfativo y potencialmente otros circuitos en el cerebro central.
Protocol
Representative Results
Discussion
El explante de antenas-cerebro de Drosophila conserva la orientación normal del circuito olfativo. Notamos que el desarrollo es 2 veces más lento ex vivo en comparación con in vivo. Se observa que el sistema de explante no retiene el palpo maxilar, que alberga seis tipos de ORN. Para garantizar que el desarrollo normal se recapite ex vivo, se debe evitar el estiramiento de los nervios antenales durante la disección del explante. Durante el cultivo ex vivo, el crecimiento d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a N. Özel y R. Hiesinger por sus consejos sobre la cultura de explantes; M. Wagner para la ayuda técnica de la microscopía de dos fotones; D.J. Luginbuhl por generar moscas transgénicas; D. Friedmann para sugerencias de análisis de programas informáticos de Fiji; Y. Ge para asistencia en el trabajo de vuelo; C. McLaughlin y K.K.L. Wong por comentarios sobre el manuscrito. L.L. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud 1K99DC01883001 (a T.L.) y R01-DC005982 (a L.L.).
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Referencias
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