הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים
Summary
פרוטוקול זה מציג בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיו, אשר שימושית להערכת צריכת חומצות אמינו בתאים ראשוניים או בעצמות מבודדות.
Abstract
התפתחות העצם וההומאוסטזיס תלויה בהתמיינות ובפעילות של אוסטאובלסטים יוצרי עצם. התמיינות אוסטאובלסט מאופיינת ברצף על ידי התפשטות ואחריה סינתזת חלבונים ובסופו של דבר הפרשת מטריצת עצם. התפשטות וסינתזת חלבונים דורשות אספקה מתמדת של חומצות אמינו. למרות זאת, מעט מאוד ידוע על צריכת חומצות אמינו באוסטאובלסטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול רגיש מאוד שנועד למדוד צריכת חומצות אמינו באמצעות חומצות אמינו מסומנות ברדיו. שיטה זו מותאמת לכימות שינויים בספיגת חומצות אמינו הקשורים להתרבות או התמיינות של אוסטאובלסט, טיפולים תרופתיים או גורמי גדילה, או מניפולציות גנטיות שונות. חשוב לציין שניתן להשתמש בשיטה זו לסירוגין כדי לכמת את צריכת חומצות האמינו בקווי תאים בתרבית או בתאים ראשוניים במבחנה או בפירי עצם מבודדים ex vivo. לבסוף, השיטה שלנו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי למדוד את ההובלה של כל חומצות האמינו, כמו גם גלוקוז וחומרים מזינים אחרים radiolabeled.
Introduction
חומצות אמינו הן תרכובות אורגניות המכילות קבוצות פונקציונליות של חומצות אמינו (-NH2) וקרבוקסיל (-COOH) עם שרשרת צדדית משתנה הספציפית לכל חומצת אמינו. באופן כללי, חומצות אמינו ידועות כמרכיב הבסיסי של חלבון. לאחרונה הובהרו שימושים חדשים ותפקודים של חומצות אמינו. לדוגמה, חומצות אמינו בודדות יכולות לעבור מטבוליזם כדי ליצור מטבוליטים ביניים התורמים לביו-אנרגיה, מתפקדים כקופקטורים אנזימטיים, מווסתים מיני חמצן תגובתי או משמשים לסינתזה של חומצות אמינו אחרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים מראים כי חילוף חומרים של חומצות אמינו הוא קריטי עבור פלוריפוטנטיות, שגשוג והתמיינות של תאים בהקשרים שונים 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
אוסטאובלסטים הם תאים מפרישים המייצרים ומפרישים את מטריצת העצם החוץ-תאית העשירה בקולגן מסוג 1. כדי לשמור על שיעורים גבוהים של סינתזת חלבונים במהלך היווצרות העצם, אוסטאובלסטים דורשים אספקה מתמדת של חומצות אמינו. כדי לענות על דרישה זו, osteoblasts חייב לרכוש באופן פעיל חומצות אמינו. בהתאם לכך, מחקרים אחרונים חושפים את החשיבות של ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בפעילות אוסטאובלסטים וביצירת עצם 15,16,17,18,19,20.
אוסטאובלסטים רוכשים חומצות אמינו תאיות משלושה מקורות עיקריים: סביבה חוץ-תאית, פירוק חלבונים תוך-תאיים וביוסינתזה של חומצות אמינו דה-נובו. פרוטוקול זה יתמקד בהערכת ספיגת חומצות אמינו מסביבה חוץ-תאית. השיטות הנפוצות ביותר למדידת ספיגת חומצות אמינו מסתמכות על חומצות אמינו בעלות תווית רדיו (למשל, 3שעות או 14מעלות צלזיוס) או על איזוטופים כבדים המסומנים (למשל, 13מעלות צלזיוס). מבחני איזוטופומרים כבדים יכולים לנתח ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בצורה יסודית ובטוחה יותר, אך לוקח להם זמן רב יותר להשלים מספר ימים מכיוון שלוקח יום להכין ולהפיק דגימות ומספר ימים לנתח בספקטרומטר המסה בהתאם למספר הדגימות21,22. לשם השוואה, מבחני ספיגת חומצות אמינו מסומנים ברדיו אינם אינפורמטיביים לגבי חילוף החומרים במורד הזרם, אך הם זולים ומהירים יחסית, וניתן להשלים אותם תוך 2-3 שעות מתחילת הניסוי23,24. כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי הניתן לשינוי בקלות, שנועד להעריך קליטת חומצות אמינו בתרבית או בקווי תאים במבחנה או בצירי עצם בודדים ex vivo. ניתן להרחיב את היישום של שני פרוטוקולים אלה לחומצות אמינו אחרות המסומנות ברדיו ולסוגי תאים ורקמות אחרים הקשורים לעצמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה מהירה ורגישה להערכת ספיגת חומצות אמינו בתגובה לתמורות ניסיוניות שונות במבחנה או ex vivo. בהשוואה לערכות הזמינות מסחרית (למשל, גלוטמין וערכת קביעת גלוטמט), שיטה זו הרבה יותר רגישה, מהירה ופחות דורשתעבודה של 16,17,25<sup …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מעבדת קרנר נתמכת על ידי מענקי R01 של המכון הלאומי לבריאות (AR076325 ו-AR071967) ל-C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
Referencias
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
