Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati
Summary
Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcato, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia nelle cellule primarie che nelle ossa isolate.
Abstract
Lo sviluppo osseo e l’omeostasi dipendono dalla differenziazione e dall’attività degli osteoblasti che formano l’osso. La differenziazione degli osteoblasti è caratterizzata sequenzialmente dalla proliferazione seguita dalla sintesi proteica e, infine, dalla secrezione della matrice ossea. La proliferazione e la sintesi proteica richiedono un costante apporto di aminoacidi. Nonostante questo, si sa molto poco sul consumo di aminoacidi negli osteoblasti. Qui descriviamo un protocollo molto sensibile progettato per misurare il consumo di aminoacidi utilizzando aminoacidi radiomarcati. Questo metodo è ottimizzato per quantificare i cambiamenti nell’assorbimento degli aminoacidi associati alla proliferazione o alla differenziazione degli osteoblasti, ai trattamenti farmacologici o dei fattori di crescita o a varie manipolazioni genetiche. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato in modo intercambiabile per quantificare il consumo di aminoacidi in linee cellulari in coltura o cellule primarie in vitro o in alberi ossei isolati ex vivo. Infine, il nostro metodo può essere facilmente adattato per misurare il trasporto di uno qualsiasi degli amminoacidi, nonché del glucosio e di altri nutrienti radiomarcati.
Introduction
Gli amminoacidi sono composti organici che contengono un gruppo funzionale amminico (-NH2) e carbossilico (-COOH) con una catena laterale variabile specifica per ciascun amminoacido. In generale, gli amminoacidi sono ben noti come costituenti di base delle proteine. Più recentemente, sono stati chiariti nuovi usi e funzioni degli amminoacidi. Ad esempio, i singoli amminoacidi possono essere metabolizzati per generare metaboliti intermedi che contribuiscono alla bioenergetica, funzionano come cofattori enzimatici, regolano le specie reattive dell’ossigeno o sono usati per sintetizzare altri amminoacidi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Molti studi dimostrano che il metabolismo degli aminoacidi è fondamentale per la pluripotenza, la proliferazione e la differenziazione cellulare in vari contesti 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Gli osteoblasti sono cellule secretorie che producono e secernono la matrice ossea extracellulare ricca di collagene di tipo 1. Per sostenere alti tassi di sintesi proteica durante la formazione ossea, gli osteoblasti richiedono un apporto costante di aminoacidi. Per soddisfare questa domanda, gli osteoblasti devono acquisire attivamente aminoacidi. Coerentemente con questo, studi recenti rivelano l’importanza dell’assorbimento e del metabolismo degli aminoacidi nell’attività degli osteoblasti e nella formazione ossea 15,16,17,18,19,20.
Gli osteoblasti acquisiscono aminoacidi cellulari da tre fonti principali: ambiente extracellulare, degradazione intracellulare delle proteine e biosintesi de novo degli aminoacidi. Questo protocollo si concentrerà sulla valutazione dell’assorbimento di aminoacidi dall’ambiente extracellulare. I metodi più comuni per misurare l’assorbimento di aminoacidi si basano su amminoacidi radiomarcati (ad esempio, 3H o 14C) o marcati con isotopi pesanti (ad esempio, 13C). I saggi di isotopomeri pesanti possono analizzare l’assorbimento degli amminoacidi e il metabolismo in modo più approfondito e sicuro, ma richiedono più tempo e richiedono più giorni per essere completati poiché ci vuole un giorno per preparare e derivatizzare i campioni e più giorni per analizzare sullo spettrometro di massa a seconda del numero di campioni21,22. In confronto, i saggi di assorbimento degli aminoacidi radiomarcati non sono informativi sul metabolismo a valle, ma sono economici e relativamente veloci, potendo essere completati entro 2-3 ore dall’inizio dell’esperimento23,24. Qui, descriviamo un protocollo di base facilmente modificabile progettato per valutare l’assorbimento di aminoacidi radiomarcati in cellule primarie in coltura o linee cellulari in vitro o singoli alberi ossei ex vivo. L’applicazione di questi due protocolli può essere estesa ad altri aminoacidi radiomarcati e ad altri tipi cellulari e tessuti associati all’osso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un approccio rapido e sensibile per valutare l’assorbimento di aminoacidi in risposta a varie permutazioni sperimentali sia in vitro che ex vivo. Rispetto ai kit disponibili in commercio (ad esempio, Glutamine and Glutamate Determination Kit), questo metodo è molto più sensibile, più veloce e meno laborioso16,17,25. Nel nostro protocollo, valutiamo l’assorbimento nel buff…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il laboratorio Karner è supportato dalle sovvenzioni R01 del National Institute of Health (AR076325 e AR071967) a C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
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